本文為大分子生物分析概論系列文章的第五篇，主要介紹LBA方法的平行性（parallelism）實(shí)驗(yàn)或研究，這是大分子藥物分析方法所特有的一項(xiàng)研究。平行性是評(píng)估配體結(jié)合式測(cè)試方法（ligand-binding assay，LBA）相對(duì)準(zhǔn)確性的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)。

在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將采用平行性研究，即通過評(píng)估稀釋對(duì)生物基質(zhì)中內(nèi)源性待測(cè)物定量的影響，來表述一個(gè)分析方法的相對(duì)準(zhǔn)確性，可以評(píng)估的基本特征包括選擇性、基質(zhì)效應(yīng)、所需的最小稀釋倍數(shù)、健康和患病人群的內(nèi)源性待測(cè)物的水平以及LLOQ。本文將比較并討論評(píng)估支持PK定量分析的LBA方法中關(guān)鍵參數(shù)的若干方法以及每種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

LBA定量分析方法，是通過比較已知藥物濃度的校準(zhǔn)品與其未知濃度的生物樣本的免疫反應(yīng)活性（immunoreactivity）來測(cè)定生物樣本中大分子藥物的濃度。對(duì)于一個(gè)性能良好的LBA方法，其校準(zhǔn)曲線（合適的logistic regression擬合結(jié)果）應(yīng)具有平行性，即能夠支持如下假設(shè)：作為測(cè)試試劑的抗體其結(jié)合特性足夠相似、可用于測(cè)定稀釋了的樣本中的待測(cè)物的濃度。導(dǎo)致非平行性的兩個(gè)主要因素是：（1）校準(zhǔn)參照（比）物質(zhì)與未知待測(cè)物之間的免疫親和力特征的差異（對(duì)捕獲和檢測(cè)試劑而言）；（2）校準(zhǔn)曲線基質(zhì)、質(zhì)量控制樣品（QC）基質(zhì)和研究人群的基質(zhì)之間基質(zhì)效應(yīng)的差異（圖1）。

圖1. 造成非平行性的主要原因。（A）校準(zhǔn)曲線: 由替代參照（比）物在替代基質(zhì)中制備校準(zhǔn)曲線；（B）天然樣本: 存在于完整的、未經(jīng)處理的基質(zhì)中的內(nèi)源性待測(cè)物。

對(duì)于旨在測(cè)定外源性蛋白藥物以支持藥代動(dòng)力學(xué)（PK）研究的LBA方法，參照（比）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通常能得到詳細(xì)的表征，且具有全面的分析證書（CoA）。用作校準(zhǔn)品的參照（比）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通常與待測(cè)物相同。外加不同濃度的待測(cè)物制備的質(zhì)量控制樣品則用于評(píng)估準(zhǔn)確度、精密度、選擇性、靈敏度和稀釋線性度，以支持最終的定量分析方法的驗(yàn)證。美國(guó)FDA指南草案、EMA指南和行業(yè)共識(shí)白皮書詳細(xì)描述了進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)的相關(guān)建議。目前，這些建議在用于PK定量分析的LBA方法驗(yàn)證中已得到廣泛地運(yùn)用。

對(duì)于測(cè)定內(nèi)源性蛋白質(zhì)，如生物標(biāo)志物（biomarker）和“游離”/“總”藥物靶標(biāo)的LBA方法的開發(fā)和認(rèn)證，相關(guān)策略將不同于PK定量分析方法。這是因?yàn)橥ǔ２淮嬖诩兓说?、完全表征的?nèi)源性參照（比）物，且不含待測(cè)物的空白基質(zhì)可能也不存在，故需要一種相對(duì)定量的方法。用于內(nèi)源性待測(cè)物如生物標(biāo)志物的LBA方法的平行性將在后續(xù)文章中作專門討論，敬請(qǐng)關(guān)注。

總而言之，平行性研究是通過評(píng)估稀釋對(duì)生物基質(zhì)中待測(cè)物定量分析的影響，來表述一個(gè)分析方法相對(duì)準(zhǔn)確性（relative accuracy）的一項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo)?？梢栽u(píng)估的相關(guān)分析方法的基本特征包括選擇性、基質(zhì)效應(yīng)、所需最低稀釋倍數(shù)（minimum required dilution, MRD）、健康和患病人群中內(nèi)源性待測(cè)物的濃度和LLOQ。

在過去的十多年中，科學(xué)文獻(xiàn)中就平行性實(shí)驗(yàn)操作和適用標(biāo)準(zhǔn)發(fā)表了許多討論結(jié)果。2003年，DeSilva等人建議使用由幾個(gè)Cmax樣本（已測(cè)樣本再分析樣本）制成的混合樣本，以支持PK方法的研究中驗(yàn)證。2011EMA指南建議使用高濃度研究樣本（Cmax研究樣本）稀釋到至少三個(gè)濃度來評(píng)估PK方法的平行性，還建議計(jì)算稀釋樣本之間的精密度以評(píng)估平行性。由于使用了真實(shí)樣本進(jìn)行平行性研究，即研究樣本中的待測(cè)物已經(jīng)處于生物基質(zhì)中，而不是外加待測(cè)物到空白生物基質(zhì)而生成研究樣本。

因此，在某種意義上用于PK定量分析的和用于生物標(biāo)志物的LBA方法在平行性研究中處于相似地位。所以，雖然本文預(yù)期只討論用于PK定量分析的LBA方法的平行性，但下面的討論往往也提到或比較二者。

本文將探討并比較相關(guān)評(píng)估關(guān)鍵參數(shù)的方法，包括平行性實(shí)驗(yàn)和其它傳統(tǒng)的方法，討論如何使用平行性數(shù)據(jù)來指導(dǎo)分析方法的開發(fā)以及每種策略的優(yōu)缺點(diǎn)。

LBA定量測(cè)定存在于生物基質(zhì)中的待測(cè)物，無(wú)需事先萃取。在理想情況下，捕獲/檢測(cè)試劑應(yīng)結(jié)合（并且僅結(jié)合）待測(cè)物，保證其不會(huì)與任何其它的蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。不幸的是，情況往往并非如此。在現(xiàn)實(shí)世界中，生物基質(zhì)中的內(nèi)源性蛋白經(jīng)常阻斷試劑與待測(cè)物的結(jié)合。內(nèi)源基質(zhì)干擾物可以特異性地或非特異性地結(jié)合捕獲/檢測(cè)試劑或待測(cè)物，使得測(cè)試信號(hào)增加或減少。

最常見的非特異性干擾是由于溶血（hemolysis）、脂肪血癥（lipemia）、抗凝劑（anticoagulant）或其他小分子有機(jī)或無(wú)機(jī)物質(zhì)的相互作用造成的。對(duì)PK定量方法的特異性干擾可能來自蛋白藥物的降解產(chǎn)物、內(nèi)源蛋白的類似物、異質(zhì)性抗體（heterophilic antibody）、人抗動(dòng)物抗體、風(fēng)濕因子、可溶性配體、抗藥物抗體、高劑量鉤效應(yīng)（high-dose hook effect）等。對(duì)于潛在的干擾物通常沒有表征良好的參照（比）物可用，而且通常不知道干擾物的性質(zhì)，因而無(wú)法直接測(cè)試所有潛在干擾物。

傳統(tǒng)上，會(huì)在方法開發(fā)階段通過外加待測(cè)物/回收率實(shí)驗(yàn)來評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)。如果制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的基質(zhì)與樣本基質(zhì)相同（例如與大多數(shù)PK定量方法一致），則二者的基質(zhì)效應(yīng)通常相似。優(yōu)化基質(zhì)的選擇更多是為了提高靈敏度（sensitivity），而不是提高準(zhǔn)確度（absolute accuracy）。對(duì)于大多數(shù)需要替代基質(zhì)的測(cè)定內(nèi)源性待測(cè)物的LBA方法，需要使用替代基質(zhì)所制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算overspiked matrix control samples中待測(cè)物的濃度，以評(píng)估絕對(duì)準(zhǔn)確度。但是，當(dāng)天然的空白基質(zhì)不可及時(shí)，則需特別謹(jǐn)慎。由于天然基質(zhì)中的內(nèi)源性待測(cè)物的濃度是使用替代基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線所測(cè)定的，因此無(wú)法保證此類測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)準(zhǔn)確度，這是由于潛在的基質(zhì)效應(yīng)差異和潛在的檢測(cè)方法靈敏度的限制。

平行性實(shí)驗(yàn)有助于理解該分析方法的相對(duì)準(zhǔn)確性（relative accuracy）。這是通過繪制測(cè)試信號(hào)與稀釋倍數(shù)或濃度的關(guān)系圖，以評(píng)估相對(duì)精度，從而評(píng)估該方法的基質(zhì)效應(yīng)。處理原始數(shù)據(jù)有幾種不同的方法。這些方法將在"平行性、稀釋線性和選擇性"的章節(jié)中討論。每個(gè)樣本的最終曲線應(yīng)該反映了測(cè)試試劑對(duì)待測(cè)物和基質(zhì)干擾物的綜合親和力（combined binding affinity）。因此，平行性的缺失可能是基質(zhì)干擾存在的標(biāo)志。

此外，通過仔細(xì)研究平行性數(shù)據(jù)的細(xì)節(jié)和趨勢(shì)，方法開發(fā)人員可以發(fā)現(xiàn)干擾類型的相關(guān)線索，隨后縮小可能引起基質(zhì)效應(yīng)的物質(zhì)范圍。例如，如果可以通過增加稀釋倍數(shù)來緩解非平行性，則可能發(fā)生了非特異性結(jié)合，可以增加該方法的MRD或優(yōu)化樣品稀釋劑（例如添加阻滯劑、洗滌劑、鹽等）來消除干擾。相反，如果不能稀釋掉基質(zhì)效應(yīng)，則有可能是特異性的干擾。抑制或增強(qiáng)結(jié)合反應(yīng)（binding reaction）可以進(jìn)一步指示可能引起干擾的結(jié)合位點(diǎn)?？梢蕴剿髯R(shí)別不同表位的新的關(guān)鍵試劑，增加樣本預(yù)處理步驟（例如，堿性處理、酸處理或萃?。?，或添加強(qiáng)力洗滌劑（strong detergent），以消除此類干擾。

選擇性是分析方法的一種能力，即在樣本中存在其他成分情況下，定量地測(cè)定待測(cè)物的能力。設(shè)計(jì)良好的LBA應(yīng)該能夠準(zhǔn)確地測(cè)定大多數(shù)受試者樣本中的待測(cè)物，而不會(huì)受到獨(dú)特的個(gè)體基質(zhì)的干擾。根據(jù)FDA指南草案、EMA指南和白皮書，應(yīng)該外加相當(dāng)于LLOQ或附近濃度的待測(cè)物到至少10個(gè)批次的人體個(gè)體基質(zhì)（動(dòng)物6個(gè)）中，用以評(píng)估選擇性。目前，此方法適用于PK樣本分析方法的監(jiān)管驗(yàn)證。

在理想情況下，應(yīng)該使用正常和/或患病的單個(gè)人源樣本進(jìn)行平行性實(shí)驗(yàn)。其中從可靠的來源（例如從醫(yī)院獲得的樣本）獲得的并帶有完整的患者醫(yī)療記錄和完整的樣品儲(chǔ)存記錄的新鮮樣本應(yīng)當(dāng)?shù)玫絻?yōu)先考慮，或者也可以使用從商業(yè)來源購(gòu)買的樣本，但是應(yīng)考慮到所購(gòu)基質(zhì)的穩(wěn)定性和可靠性。

通常，稀釋樣本的回計(jì)算濃度可用于評(píng)估定量分析方法的平行性。Stevenson和Purushothama進(jìn)一步建議，分析人員可繪制稀釋后調(diào)整的濃度（dilution-adjusted concentration）與多個(gè)個(gè)人樣本稀釋的示意圖，這可以幫助設(shè)定方法的MRD并評(píng)估方法的選擇性。

MRD設(shè)置應(yīng)當(dāng)使得大多數(shù)樣品在分析方法的定量范圍內(nèi)，并且保證MRD以外的多次稀釋仍然能得到準(zhǔn)確的結(jié)果。歐洲生物分析論壇專題小組總結(jié)了處理并行數(shù)據(jù)的替代方法。這些方法包括繪制log[微孔內(nèi)測(cè)定濃度]與稀釋倍數(shù)的關(guān)系圖、稀釋后調(diào)整的濃度與稀釋倍數(shù)的關(guān)系圖、稀釋調(diào)整的相對(duì)誤差（dilution-adjusted relative error）與稀釋倍數(shù)的關(guān)系圖以及l(fā)og[微孔內(nèi)濃度]與log[1/稀釋倍數(shù)] 的關(guān)系圖。這些基于回算濃度的方法允許方法開發(fā)人員根據(jù)預(yù)先設(shè)定的接受標(biāo)準(zhǔn)來評(píng)估該方法的平行性。

對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行恰當(dāng)?shù)亟忉寯?shù)據(jù)有助于獲取有利信息。例如平行性缺失可以從兩個(gè)方面來解釋：（1）樣本之間缺乏平行性代表基質(zhì)效應(yīng)和試劑的選擇性（選擇性）問題；（2）校準(zhǔn)品和樣本之間缺乏平行性，即如果所有樣本彼此平行但不平行于校準(zhǔn)曲線，則代表基質(zhì)效應(yīng)，或參照（比）物的特異性（specificity）問題，或兩者情況都有。參照（比）物的特異性（specificity）問題則說明參照（比）物的質(zhì)量（quality）存在問題。

圖2顯示了根據(jù)Stevenson和Purushothama的建議，對(duì)可溶性BCMA（sBCMA）方法案例研究數(shù)據(jù)的處理。在本案例研究中，連續(xù)稀釋10個(gè)正常人類血清樣本，使用1%牛血清白蛋白（BSA）磷酸緩沖鹽水（PBS）緩沖液，或1%BSA PBS加0.50%（v/v）Triton X-100緩沖液。校準(zhǔn)曲線分別在1%BSA PBS緩沖液以及1%BSA PBS加0.50%（v/v）Triton X-100緩沖液中制備。然后繪制稀釋后調(diào)整的濃度與[1/稀釋倍數(shù)]的關(guān)系圖，以評(píng)估方法的平行性。

圖2.使用“稀釋后調(diào)整的濃度‘dilution-adjusted concentration’”方法，可溶性BCMA ELISA方法測(cè)定的10個(gè)正常人血清樣本的平行性評(píng)價(jià)。(A)樣品1-5（男），使用1%BSA PBS緩沖液稀釋；(B)樣品6-10（女），使用1%BSA PBS緩沖液； (C)樣品1-5（男），使用1%BSA PBS+0.50%（v/v）Triton X-100緩沖液稀釋；(D)樣品6-10（女），使用1%BSA PBS+0.50%（v/v）Triton X-100緩沖液稀釋。BSA：牛血清白蛋白；PBS：磷酸鹽緩沖生理鹽水。

這些數(shù)據(jù)表明，使用1% BSA PBS緩沖液作為替代基質(zhì)時(shí)，大多數(shù)受試者的樣本沒有達(dá)到平行性（圖2A-B）。然而，使用1% BSA PBS加0.50%（v/v）Triton X-100緩沖液在1：27或更大稀釋倍數(shù)時(shí)，則顯示了平行性（圖2C-D）。

當(dāng)校準(zhǔn)曲線不存在或與樣品不平行時(shí)，完整和稀釋后樣本的回算濃度要么不存在，要么不準(zhǔn)確。所以，使用依賴于回算濃度以評(píng)估樣本之間平行性的方法可能會(huì)得出有誤導(dǎo)性的結(jié)論，建議直接從分析儀器獲取原始測(cè)試信號(hào)以評(píng)估樣本的平行性。

對(duì)于LBA定量方法，測(cè)試信號(hào)與濃度/稀釋倍數(shù)之間的相關(guān)性通常不是線性的。因此，線性關(guān)系圖不能準(zhǔn)確反映樣本之間的平行性。建議使用加權(quán)或無(wú)加權(quán)的4或5參數(shù)logistic回歸（4PL或5PL）模型，以實(shí)現(xiàn)最小方差的最佳曲線擬合。從圖中直接可以看到每個(gè)樣本稀釋曲線的平行關(guān)系，并可以評(píng)價(jià)樣本之間的平行性。一個(gè)局限是不清楚如何為"原始測(cè)試信號(hào)"方法設(shè)置固定的接受標(biāo)準(zhǔn)。每個(gè)樣本的"B"參數(shù)（"B"表示4PL和5PL的希爾曲線斜率）可用于評(píng)估方法平行性。也可以進(jìn)一步評(píng)估并應(yīng)用更多的統(tǒng)計(jì)方法，以便更好地解釋數(shù)據(jù)。

圖3演示了如何使用“原始測(cè)試信號(hào)”進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，本圖使用了同一個(gè)sBCMA案例研究中的數(shù)據(jù)，繪制了10個(gè)樣本的光密度與[1/稀釋倍數(shù)]的關(guān)系圖。校準(zhǔn)曲線的回歸模型是4PL，由測(cè)試儀器軟件SoftMax? Pro完成回歸分析。實(shí)驗(yàn)使用1% BSA PBS緩沖液作為替代基質(zhì)（圖3A-B）時(shí)，這10個(gè)樣本的B參數(shù)的范圍是從0.33到1.11不等，而使用1%BSA PBS加上0.50%（v/v）Triton X-100 緩沖液（圖3C-D）作為替代基質(zhì)時(shí)，B參數(shù)的范圍為1.25到1.46。這些數(shù)據(jù)表明，在樣本稀釋劑（sample diluent）中加入0.50%（v/v）Triton X-100，減輕了樣本的基質(zhì)效應(yīng)并改善了方法的平行性。

圖 3. 可溶性B細(xì)胞成熟抗原ELISA測(cè)定方法的平行性評(píng)估。基于10個(gè)正常人血清樣本，并使用"原始信號(hào)"方法和4PL回歸模型進(jìn)行曲線擬合。(A)樣品1-5（男），使用1% BSA PBS緩沖液稀釋；(B)樣品6-10（女），使用1% BSA PBS緩沖液；(C)樣品1-5（男），使用 1%BSA PBS+0.50%（v/v）Triton X-100緩沖液稀釋；(D)樣品6-10（女），使用1%BSA PBS+0.50%（v/v）Triton X-100緩沖液稀釋。BSA：牛血清白蛋白；PBS：磷酸鹽緩沖生理鹽水。

"原始信號(hào)"方法的進(jìn)一步應(yīng)用是可以很輕松地優(yōu)化緩沖液，而不需要在每個(gè)不同的緩沖液中制備一條校準(zhǔn)曲線。圖4演示了使用"原始測(cè)試信號(hào)"方法為替代基質(zhì)的優(yōu)化，進(jìn)而處理數(shù)據(jù)。使用1%BSA PBS緩沖液連續(xù)稀釋3個(gè)正常人血清樣本，稀釋劑中不含Triton X-100，然后分別加入0.25、0.50和1.00%（v/v）的Triton X-100。所有稀釋的樣品都在同一微孔板上分析，無(wú)需添加校準(zhǔn)曲線。再利用光學(xué)密度與[1/dilution]曲線關(guān)系圖評(píng)價(jià)該方法的平行性。數(shù)據(jù)表明，添加了Triton X-100的3組樣本其平行性都得到了提高。最終，1%BSA PBS加上0.50%（v/v）Triton X-100緩沖液被選為替代基質(zhì)，以更好地評(píng)估方法的穩(wěn)健性。

圖 4. 使用"原始信號(hào)"方法優(yōu)化替代基質(zhì)。采用4PL模型進(jìn)行曲線回歸擬合。（A）使用 1%BSA PBS緩沖液稀釋的樣品（優(yōu)化之前）；（B）使用1% BSA PBS+0.25%（v/v）Triton X-100稀釋的樣本；（C）使用1% BSA PBS+0.50%（v/v）Triton X-100稀釋的樣本；（D）使用1% BSA PBS+1.0%（v/v）Triton X-100稀釋的樣本。BSA：牛血清白蛋白；PBS：磷酸鹽緩沖生理鹽水。

由于為"原始信號(hào)"設(shè)置固定的接受標(biāo)準(zhǔn)的方法尚不確定，因此在解決非平行性問題后，應(yīng)使用"稀釋調(diào)整濃度dilution-adjusted concentration’approach "方法來確認(rèn)該方法的平行性：即使用與樣本稀釋緩沖液相同的緩沖液來制備校準(zhǔn)曲線。

盡管其優(yōu)點(diǎn)顯而易見，但使用平行性實(shí)驗(yàn)來評(píng)估方法的選擇性顯然也存在著挑戰(zhàn)：并非總能獲得足夠多且含有高濃度內(nèi)源性待測(cè)物的樣本。另一種方法是：對(duì)多個(gè)加入標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)物的單個(gè)樣本進(jìn)行稀釋線性度實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估方法的選擇性。加標(biāo)樣品的正常濃度可設(shè)置為內(nèi)源性水平加上外加待測(cè)物的濃度?；蛘呒訕?biāo)濃度可以直接用作標(biāo)稱濃度，在減去內(nèi)源性濃度（偏置計(jì)算bias calculation）后，可以獲得正確的測(cè)定濃度。這個(gè)概念和數(shù)據(jù)評(píng)估策略應(yīng)該與平行實(shí)驗(yàn)中所使用的策略相同。

其他平行實(shí)驗(yàn)的挑戰(zhàn)可能包括：當(dāng)需要特殊基質(zhì)類型（如腦脊液、組織勻漿）或基質(zhì)物種（如小鼠）時(shí)，有限的可用小樣本體積可能不足以允許進(jìn)行多次稀釋后進(jìn)行生物分析。此外，沒有統(tǒng)一的方法為每個(gè)樣本設(shè)置標(biāo)稱濃度，并評(píng)估方法的平行性。標(biāo)稱濃度可以設(shè)置為來自最大稀釋倍數(shù)，且其濃度高于LLOQ的MRD樣本，或者是顯示出平行性的所有稀釋后濃度的平均值。也可以通過計(jì)算每個(gè)稀釋后濃度與標(biāo)稱濃度的百分比偏差，或者所有稀釋后濃度的百分比CV（%CV）評(píng)估平行性。

特異性是測(cè)試用關(guān)鍵試劑（例如抗體）區(qū)分待測(cè)物和其他成分的能力。LBA測(cè)量的是結(jié)合性反應(yīng)活性，而不是直接測(cè)定質(zhì)量。任何能夠與關(guān)鍵試劑結(jié)合的物質(zhì)都可以生成測(cè)試信號(hào)，不論其特異性和親和力如何。這是所有LBA都會(huì)存在的特異性的固有問題。大多數(shù)LBA方法特異性測(cè)試的目標(biāo)并非為了檢測(cè)絕對(duì)的特異性，而是為達(dá)到預(yù)期的應(yīng)用目的，提供有關(guān)被測(cè)物的信息。

LBA方法的特異性取決于關(guān)鍵試劑的特異性。特異性試劑需要在其他技術(shù)（如western blot、surface plasmon resonance、HPLC、LC-MS/MS等）的協(xié)助下，進(jìn)行設(shè)計(jì)、確認(rèn)和選擇。當(dāng)前的特異性測(cè)試方案，采用了學(xué)習(xí)-確認(rèn)的方法。分析方法的特異性是通過計(jì)算使用外加了各種形式的潛在交叉反應(yīng)物的樣本的準(zhǔn)確性來評(píng)估的。但是這是假設(shè)在干擾物質(zhì)是已知的前提下，以基質(zhì)或純化物的形式而提供的。

平行性實(shí)驗(yàn)可以間接地評(píng)估分析方法的特異性。在方法優(yōu)化后，如果在樣本內(nèi)以及樣本和校準(zhǔn)品曲線之間不能取得平行性，則關(guān)鍵試劑的特異性應(yīng)視為可疑。換句話說，在排除了非特異性相關(guān)的基質(zhì)效應(yīng)和參照（比）物的特異性問題之后，關(guān)鍵試劑的特異性可能是導(dǎo)致非平行性的主要原因。但是，與校準(zhǔn)品曲線平行的樣本稀釋也并不能保證分析方法的特異性。有這樣一個(gè)例子，在一個(gè)方法比較實(shí)驗(yàn)中，使用LC-MS/MS方法（靈敏度約為20 pg/ml）來測(cè)試所有樣品中的一個(gè)相關(guān)小分子生物標(biāo)志物，檢測(cè)結(jié)果是在所有樣本均未檢測(cè)到。但是，當(dāng)使用商業(yè)ELISA試劑盒檢測(cè)時(shí)，所有樣本卻均顯示出可測(cè)量到的濃度，并且9個(gè)樣本中有6個(gè)樣本取得了平行性（表1）。

表1. 一個(gè)小分子生物標(biāo)志物L(fēng)BA方法的平行數(shù)據(jù)

有兩個(gè)與靈敏度相關(guān)的術(shù)語(yǔ)：LOD（limit of detection）和 LLOQ（lower limit of quantitation）。LOD是指產(chǎn)生與背景明顯不同信號(hào)的濃度（例如背景平均值±2或3標(biāo)準(zhǔn)方差），它通常作為靈敏度指標(biāo)，供生物標(biāo)志物研究使用 （research use only，RUO）或供診斷試劑盒使用。LLOQ是指已被證明具有可以接受的準(zhǔn)確度、精密度和總誤差水平的待測(cè)物的最小濃度。LLOQ通常大于LOD。

傳統(tǒng)上，生物分析LBA方法的靈敏度（LLOQ）是在執(zhí)行準(zhǔn)確度和精密度運(yùn)行時(shí)中確定的，樣本是將參照（比）標(biāo)準(zhǔn)物加入到空白基質(zhì)而制備的。Stevenson and和Purushothama建議分析來自同一平行性實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，但使用校準(zhǔn)曲線上的濃度（即稀釋后，調(diào)整濃度之前）來確定檢測(cè)內(nèi)源性待測(cè)物的靈敏度。他們提出了兩種不同的方法來確定LLOQ。

常用稀釋方法（common dilution method）是將在最大稀釋倍數(shù)時(shí)給出平行響應(yīng)的所有單個(gè)樣本中觀察到的最高濃度定為L(zhǎng)LOQ。但使用該種辦法時(shí)存在一個(gè)不足，就是當(dāng)至少一個(gè)樣本的內(nèi)源性濃度明顯高于其他樣品時(shí)，確定的LLOQ將高于真正的LLOQ。而另一種方法，共同濃度方法（common concentration method）是將所有樣品都表現(xiàn)出平行性的最高濃度確定為L(zhǎng)LOQ。換言之，任何高于確定LLOQ濃度的樣本，都通過平行實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出相對(duì)的準(zhǔn)確度。對(duì)sBCMA案例研究的數(shù)據(jù)，使用了"共同濃度方法"（表2）。

表2. 使用"共同濃度方法"確定可溶性BCMA分析方法的LLOQ

總之，平行實(shí)驗(yàn)是指導(dǎo)早期方法開發(fā)和優(yōu)化的有力工具。它直接評(píng)估待測(cè)物的內(nèi)源性濃度、測(cè)定基質(zhì)效應(yīng)、選擇性和靈敏度，它也是方法特異性的一個(gè)間接指標(biāo)。圖5顯示了一個(gè)使用平行數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)性方法開發(fā)和優(yōu)化的策略決策樹。

圖5.使用平行性/稀釋線性度實(shí)驗(yàn)，以指導(dǎo)方法開發(fā)的決策樹

可按質(zhì)量級(jí)別（quality level）或預(yù)期用途對(duì)商用試劑盒進(jìn)行分類。無(wú)論是用于化驗(yàn)室測(cè)試的商業(yè)試劑盒（以支持臨床診斷或預(yù)后），還是用于支持藥物開發(fā)的生物分析測(cè)試，方法開發(fā)的目標(biāo)都是一樣的，即建立一個(gè)有足夠準(zhǔn)確度和靈敏度的、符合預(yù)期用途的、可靠的定量分析方法。

生物分析業(yè)界討論了使用商業(yè)試劑盒開發(fā)和驗(yàn)證定量分析方法的策略，F(xiàn)DA指南草案和EMA指南指出：需要重新驗(yàn)證用于藥物開發(fā)目的的商業(yè)試劑盒，以確保其可靠性。業(yè)界中不同的組織在相關(guān)綜述或研究論文中總結(jié)了當(dāng)前商業(yè)試劑盒所面臨的挑戰(zhàn)以及關(guān)于如何采納和調(diào)整商業(yè)試劑盒的建議。也有相關(guān)白皮書討論了使用singleplex and multiplex試劑盒的方法的驗(yàn)證建議。試劑盒的最終用戶還發(fā)表了一些案例研究，展示了他們采用和認(rèn)證研究級(jí)別試劑盒的策略，這些試劑盒來自不同的供應(yīng)商，并且用于不同的目的。詳見文末的參考文獻(xiàn)。

簡(jiǎn)而言之，需要確認(rèn)參考照（比）物料和關(guān)鍵試劑的質(zhì)量和批次間的變異性，也需要確認(rèn)或重新建立測(cè)試方法的LLOQ和MRD，也可能需要優(yōu)化緩沖液和稀釋劑，并且在有必要時(shí)優(yōu)化檢測(cè)步驟。而評(píng)估上述所有內(nèi)容最有效的方法則是通過平行性實(shí)驗(yàn)。因此，強(qiáng)烈建議在方法開發(fā)的早期階段進(jìn)行平行性實(shí)驗(yàn)。如果在研究期間觀察到非平行性，則建議使用相同的故障排除路線（見圖5）。

圖5.使用平行性/稀釋線性度實(shí)驗(yàn)，以指導(dǎo)方法開發(fā)的決策樹。

與單通路LBAs相比，且考慮到節(jié)省樣本體積和分析時(shí)間，多通路復(fù)用的LBAs似乎更具吸引力。但是，由于檢測(cè)環(huán)境極其復(fù)雜，大多數(shù)多通路復(fù)用測(cè)試方法暫無(wú)法達(dá)到與單通路測(cè)試方法相同的質(zhì)量水平。

關(guān)于符合其用途（fit-for-purpose）的多通路復(fù)用LBA方法的驗(yàn)證，Jani等人指出，除了面臨與單通路LBA方法相同的挑戰(zhàn)外，對(duì)于多通路復(fù)用LBA方法的開發(fā)還需要考慮其它獨(dú)特的挑戰(zhàn): 包括所有待測(cè)物的定量范圍和MRD的設(shè)置，不同試劑抗體對(duì)和待測(cè)物之間的交叉反應(yīng)（cross-reactivity）以及串?dāng)_（crosstalk），由于well-to-well or spot-to-spot physical‘carryover殘留’所造成的串?dāng)_。

平行性研究（parallelism）或外加待測(cè)物的稀釋線性度（spiked dilutional linearity）實(shí)驗(yàn)可以應(yīng)對(duì)上面所列舉的挑戰(zhàn): (1)靈敏度和MRD：可以使用與單通路LBA相同的方法，對(duì)每個(gè)待測(cè)物設(shè)置靈敏度要求，應(yīng)當(dāng)選擇對(duì)所有待測(cè)物實(shí)現(xiàn)平行性的最大稀釋度作為方法的MRD；(2)交叉反應(yīng)：可以通過將不同濃度的捕獲或檢測(cè)抗體分別加入到不同的樣本中，然后進(jìn)行平行性實(shí)驗(yàn)來評(píng)估；(3)串?dāng)_（Crosstalk）：可以通過將每個(gè)高濃度待測(cè)物分別外加到不同的樣本中，然后進(jìn)行稀釋線性度（spiked dilutional linearity/spiked parallelism）實(shí)驗(yàn)來評(píng)估，或者可以選擇一個(gè)樣本，其某個(gè)待測(cè)物的內(nèi)源性濃度顯著地高于其他待測(cè)物（如果有的話），然后進(jìn)行平行性實(shí)驗(yàn)。

當(dāng)然還有其他辦法可以解決交叉反應(yīng)和串?dāng)_的問題。如“失蹤的人（Missing man）技術(shù)”，即除一種試劑外，每次將所有關(guān)鍵試劑均添加到測(cè)試中，可用于評(píng)估試劑的交叉反應(yīng)。此外，改變一個(gè)待測(cè)物的濃度，同時(shí)保持其它待測(cè)物處于低濃度范圍，是解決串?dāng)_問題的另一個(gè)方法。如果使用商業(yè)試劑盒，會(huì)由于重復(fù)這些實(shí)驗(yàn)而造成較高的復(fù)雜性和成本，如果有可能的話建議始終從試劑盒生產(chǎn)商處獲取相關(guān)原始數(shù)據(jù)的副本。

平行性實(shí)驗(yàn)可用于研究LBA分析方法的基質(zhì)效應(yīng)、選擇性和靈敏度等問題。然而，作為所有LBA方法都存在的問題，并不能直接通過平行性實(shí)驗(yàn)來研究方法的特異性（specificity）。但在方法優(yōu)化之后，若樣本分析中出現(xiàn)了平行性的缺失，則很可能是由于其特異性不佳。

LBA方法的特異性（specificity）取決于關(guān)鍵的測(cè)試試劑（例如，抗體對(duì)）。關(guān)鍵試劑的特異性必須由供應(yīng)商或最終用戶進(jìn)行評(píng)估，以確保方法的效能。平行性數(shù)據(jù)的數(shù)學(xué)解釋為表征LBA方法的特異性提供了一些線索。此外，還可以評(píng)估和使用更多的數(shù)學(xué)或統(tǒng)計(jì)工具，以便從平行性數(shù)據(jù)中找出更多細(xì)節(jié)（關(guān)于試劑結(jié)合待測(cè)物、干擾物的活性）。其他技術(shù)如western blot，surface plasmon resonance，HPLC和LC-MS/MS，也可助于確定非平行性的根本原因，分析人員應(yīng)根據(jù)需要適當(dāng)使用這些技術(shù)。

然而，對(duì)用于內(nèi)源性待測(cè)物的LBA方法，尚不清楚特異性表征到什么程度才是足夠的。且如果要確定絕對(duì)的特異性（事實(shí)上并不總是需要），就需要投入大量的資源，而這些資源本可以在其它地方使用，因?yàn)?/span>開發(fā)具有良好特征的內(nèi)源性LBA的最終目標(biāo)是確保它們具有足夠的靈敏度和準(zhǔn)確度，以定量分析想要測(cè)量的變化和物質(zhì)。

平行性研究是通過評(píng)估稀釋對(duì)生物基質(zhì)中待測(cè)物定量分析的影響，來表述相對(duì)準(zhǔn)確性的一項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo)。可以評(píng)估的相關(guān)分析方法的基本特征包括選擇性、基質(zhì)效應(yīng)、所需最低稀釋倍數(shù)、健康和患病人群中內(nèi)源性待測(cè)物的濃度和LLOQ。

下面將簡(jiǎn)單介紹對(duì)于這類LBA方法應(yīng)如何進(jìn)行類似的評(píng)估。

表3顯示了使用平行性、稀釋線性度（加標(biāo)平行性）和加標(biāo)/回收方法來評(píng)估內(nèi)源性LBA方法關(guān)鍵參數(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)。與大多數(shù)外源性藥物的定量方法不同，內(nèi)源性（例如，生物標(biāo)志物）LBA方法通常需要替代參照（比）標(biāo)準(zhǔn)物和不含有待測(cè)物的替代基質(zhì)。用于內(nèi)源性LBA的照（比）標(biāo)準(zhǔn)物，通常既非高度純化，也非表征良好，且很可能不能完全代表待測(cè)的內(nèi)源性蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)通常是異質(zhì)性（heterogeneous）的，在其天然基質(zhì)中存在著多個(gè)異構(gòu)體（isoforms）。

表3.平行性、稀釋線性度和加標(biāo)/回收方法（spike/recovery）的優(yōu)缺點(diǎn)以及相關(guān)評(píng)估參數(shù)

替代基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)由于基質(zhì)生物學(xué)的不同，通常會(huì)不同于正常人或目標(biāo)疾病人群的基質(zhì)。用于內(nèi)源性待測(cè)物的LBA方法的所有獨(dú)特特性使得這樣的分析方法往往難于使用與傳統(tǒng)的完全定量的PK方法相同的方式去進(jìn)行開發(fā)和評(píng)估。開發(fā)具有良好特征的、相對(duì)定量的LBA方法的首要目標(biāo)是區(qū)分疾病和正常人群（即以診斷/預(yù)后為目的），或區(qū)分來自經(jīng)藥物治療/未經(jīng)治療的個(gè)別樣本（即以藥物開發(fā)為目的），而不是測(cè)定每個(gè)樣本的實(shí)際真實(shí)濃度。

加標(biāo)/回收實(shí)驗(yàn)被證明是用于完全定量PK的LBA方法的開發(fā)和驗(yàn)證最有效的和應(yīng)用廣泛的方法，但相對(duì)精度的測(cè)試方法并不總是需要做這些實(shí)驗(yàn)。當(dāng)樣本沒有足夠高的內(nèi)源性待測(cè)物濃度以支持平行性實(shí)驗(yàn)時(shí)，加標(biāo)稀釋線性度的實(shí)驗(yàn)可用于證明分析方法的相對(duì)準(zhǔn)確度。需要仔細(xì)測(cè)試外加的參照（比）標(biāo)準(zhǔn)物和內(nèi)源性天然蛋白之間的差別。

盡管生物分析業(yè)界就如何進(jìn)行平行性實(shí)驗(yàn)以及如何評(píng)估平行性數(shù)據(jù)尚未達(dá)成完全的共識(shí)，但這不影響將平行性數(shù)據(jù)用于方法開發(fā)和優(yōu)化。平行性實(shí)驗(yàn)是一個(gè)強(qiáng)大的工具，可以解決用于內(nèi)源性待測(cè)物定量的LBA方法的基本問題（方法的特異性除外）。平行性實(shí)驗(yàn)也提供了對(duì)最接近實(shí)際研究樣本的模仿，并且為相對(duì)定量的和適合其用途（fit-for-purpose）的分析方法的設(shè)計(jì)提供了充分的信息。

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