此前，“袁來如此”專欄就抗體藥物和靶標生物分析數(shù)據(jù)的具體應(yīng)用以及mAb和L的結(jié)合可能產(chǎn)生的問題展開了詳細介紹(袁來如此｜大分子生物分析概論（七_）上：LBA測定抗體藥物與其靶標的總/游離濃度)，本期將延續(xù)上期內(nèi)容，重點關(guān)注抗體藥物的定量和靶配體的生物分析方法。
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雖然可以設(shè)計LBA用來測量mAbfree或mAbtotal，但受試劑限制、樣本稀釋等影響，并不能確定該方法是否僅僅測定mAbfree。因此，可以采取測定mAbtotal的策略。mAbtotal和mAbfree的分析方法見表6，典型的ELISA檢測格式見圖2。
由于特異性試劑通常是不可及的，所以在臨床前階段通常采用測定mAbtotal的“通用”分析方法。為了與試驗物種IgGs的交叉反應(yīng)最小化，可以使用抗輕鏈（anti-light-chain）和/或亞型特異性（subclass-specific）試劑（例如圖2的a、b使用抗Fc試劑）。同樣的方法可以用于多種動物和不同的候選藥物，但是對于每個物種，仍然需要驗證每個mAb方法。
“通用”分析方法可以作為一種“現(xiàn)成的（off-the-shelf）”方法使用，在早期開發(fā)中，僅需要很少的優(yōu)化（在確定特定的測試試劑之前）。然而，這種格式的分析方法不適用于臨床樣本的檢測，因為其中含有mg/mL級別的人體內(nèi)源性IgG的干擾，需要外加待測物，回收實驗評價來確認無內(nèi)源性組分的干擾。此外，該方法對活性（active）mAb藥物沒有特異性，但可能會與變性了的（denatured）、化學或蛋白酶降解后的mAb發(fā)生反應(yīng)。
互補配對的格式使用的非抑制性抗CDR抗體試劑（抗體試劑識別mAb超可變區(qū)域上不參與L結(jié)合位點的抗原表位）和通用試劑方法是一種可以用于臨床樣本的檢測方法（例如,圖2a使用anti-mAb試劑）。在臨床樣本中，這種互補決定區(qū)域(complementarity-determining regions，CDR)的抗原表位不會出現(xiàn)在內(nèi)源性人類IgG上。但是卻很難獲得這樣的non-inhibitory anti-CDR mAb試劑。另外，如果使用多克隆抗體試劑，在藥物開發(fā)項目的生命周期中，維護試劑批次間的一致性也是一個挑戰(zhàn)。
對特異于mAbfree的測試格式，一對試劑中至少有一個試劑必須與待測物的同一位點結(jié)合。這些試劑可能是與L競爭結(jié)合的anti-idiotypic抗體（即inhibitory anti-ids）或者是L本身（圖2c， d）。這種分析方式的一個變種源自試劑的組合應(yīng)用（例如，“橋接bridging”格式中，使用相同的試劑捕獲和檢測mAb，L作為捕獲試劑，與anti-idiotypic抗體進行結(jié)合檢測，反之亦然）。橋接格式的一個優(yōu)點是為了能夠被檢測到，mAb必須要有兩個functionally free結(jié)合位點。使用L的捕獲方式要求mAb只有一個供檢測的游離結(jié)合位點，并且對游離和部分游離的藥物都有特異性。但分析結(jié)果并沒有揭示這兩種形式的相對比例。
在mAbfree的競爭式分析格式中，標記的mAb（例如biotin或horseradish peroxidase標記的）允許與樣本中未標記的mAb競爭，以結(jié)合特定的捕獲試劑。標記的mAb的數(shù)量將與樣本中mAb的數(shù)量成反比。但是競爭式方法可能不如非競爭式方法的穩(wěn)健性好。
雖然mAbfree代表擁有物活性的形式，是藥代動力學家們的首選，但實際上，即使是設(shè)計良好的分析方法，對體內(nèi)mAbfree濃度的定量也存在著挑戰(zhàn)性。正如《結(jié)合平衡和對mAbtotal/mAbfree分析方法的挑戰(zhàn)》中所討論的，樣品采集條件、處理過程或分析方法都可以對平衡做出干擾影響，改變mAbfree的比例。
作為替代方法，樣品中mAbfree、Lfree和mAb-L的濃度可由mAbtotal和Ltotal來計算。但是計算是以平衡方程為基礎(chǔ)的，這需要對體內(nèi)平衡解離常數(shù)（Kd）有很好的估算。因為動態(tài)平衡將隨著不同的mAb和相應(yīng)的L濃度而發(fā)生變化，所以需要在存在過量L的情況下檢測mAb，然后根據(jù)經(jīng)驗判定它確實是mAbtotal或mAbfree的測試方法。
圖3展示了測試L對mAb干擾的示例。以不同的摩爾比預(yù)孵育L和mAb，達到平衡后，用特定ELISA來測定mAb的濃度。以L/mAb的摩爾比為X軸，抑制率為Y軸繪圖。對于mAbfree的測定，IC50將接近1。但需要注意的是，用于測試的重組L可能不能完全與其內(nèi)源性形式一樣地結(jié)合mAbfree，而導致IC50偏離真實值。
此外，選擇一致和穩(wěn)健的分析方法來支持mAb產(chǎn)品的臨床開發(fā)也很重要。如果需要改變方法，應(yīng)同時使用外加藥物的樣本和真實的研究樣本進行方法比較，以確定改變分析方法對PK數(shù)據(jù)的影響。
Ltotal展示了有關(guān)mAb對L累積的影響的信息。由于mAb的半衰期通常比循環(huán)系統(tǒng)中L的半衰期長，給藥后形成的mAb-L可能不會像Lfree那樣快速清除。此外，在某些情況下，作為給藥后的響應(yīng)，膜受體形式中L表達的上調(diào)或可溶性L的合成可能增加血液循環(huán)中L的濃度。
用于Ltotal的分析方法有多種。表7列舉了相關(guān)方法并總結(jié)了這些方法的應(yīng)用和局限性。
在給藥過程中，監(jiān)測Lfree對確定有效劑量具有重要意義。試劑的選擇對Lfree分析的影響與對mAbfree相似，但更加復(fù)雜。在許多情況下，與膜結(jié)合的L相比，組織中的可溶性L含量較低，可能需要高靈敏度的分析方法來測定Lfree的正常水平。在大多數(shù)情況下，mAb/L的高摩爾比對給藥后Lfree定量分析的準確度造成了一定的阻礙。但即便如此，仍可獲得Lfree的相對趨勢，以提供有關(guān)mAb的影響和維持所需的Lfree水平等有價值的信息。
表8總結(jié)了臨床前和臨床階段用于測定Lfree的方法，圖5展示了典型的測定Lfree的分析方法。特異性的抑制性抗L抗體或mAb（或mAb模擬物）可作為捕獲試劑，而特異性的非抑制性抗L抗體可作為檢測試劑（圖5a）。但是解離結(jié)合形式的L（bound form of L）的樣本處理步驟和分析條件可能會導致檢測值偏高(見《結(jié)合平衡和總/游離型分析的挑戰(zhàn)》)。
另一種方法是通過分子篩、固相萃取或親和分離法，在LBA分析之前，去除結(jié)合形式的L(圖5b，如使用G蛋白、A蛋白或抗人FC柱)。然而，由于柱子或過濾器表面的吸附作用，這些額外的步驟可能會帶來誤差，而且在這些分離過程中也可能會發(fā)生解離。因此，Lfree的數(shù)據(jù)只能顯示出相對的趨勢，而不能作為絕對的定量結(jié)果。
在使用樣本制備方法開發(fā)Ltotal和Lfree測定方法的時候，需要重點評估在預(yù)期濃度范圍內(nèi)的Lrecovery（L的回收率）以及在預(yù)期有或沒有mAb的基質(zhì)中，評估來自樣本基質(zhì)和其它相關(guān)結(jié)合蛋白的干擾。重要的是要確認在使用最終方法時測定的值是Ltotal還是Lfree?？梢圆捎貌煌琺Ab/L摩爾比進行干擾測試，類似于圖3所示的實驗。
測定靶標配體 (Ltotal或者Lfree)可以提供一些重要的信息，包括證明mAb與L的體內(nèi)結(jié)合、靶點占用率、有效的mAb濃度以及PK/PD關(guān)系。
測定L的準確度取決于標準參照（比）物和試劑的質(zhì)量。當不能獲得內(nèi)源性L的標準參照（比）物時，可以使用重組或合成的L標準參照（比）物。定量的準確度取決于標準參照（比）物與內(nèi)源性待測物這二者與測試試劑結(jié)合的相對活性（relative binding activity）。
在分析方法驗證的過程中，應(yīng)評估Ltotal的平行性，以確定該方法是否能像標準參照（比）物一樣識別內(nèi)源性的L。如果缺乏平行性數(shù)據(jù)，該分析方法只能是半定量的，所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)必須在此背景下進行解釋。當沒有足夠高濃度的內(nèi)源性L樣本來評估平行性時，解釋數(shù)據(jù)時應(yīng)該謹慎使用絕對濃度這樣的術(shù)語。在這種情況下，L的相對變化趨勢將更加可靠。
為了適當?shù)厥褂煤徒忉屔锓治鰯?shù)據(jù)，了解數(shù)據(jù)的可靠性和局限性是至關(guān)重要的。在LBA方法中，捕獲和檢測試劑是決定該方法的特異性（針對游離的、結(jié)合的或總濃度的特異性）的關(guān)鍵組成成分。理解mAb/L的比值和動態(tài)平衡對于選擇最合適的格式進行方法開發(fā)是至關(guān)重要的。
此外，在疾病模型或特定患者群體中，靶標配體的狀況可能與健康對照群體有著非常不同的情況，所以了解在不同物種和疾病狀態(tài)中出現(xiàn)的mAb/L比值的可變性也很重要。即使擁有高度表征的試劑，也應(yīng)該理解mAb-L在體內(nèi)是以動態(tài)平衡的方式存在的，因此體外（ex vivo）的測試條件（例如樣本稀釋和孵育時間）會影響mAb和L的定量以及它們兩者之間的平衡，可以通過研究mAb-L平衡，分析操作步驟，評估實驗結(jié)果，來判斷它們是否真實反映了研究樣本中的結(jié)合關(guān)系（binding relationships）。本文的表格中所列出的樣品處理策略和定量方法，經(jīng)常適用于方法開發(fā)，其目的是定量分析游離（free）的、總體（total）的和結(jié)合了（bound）的mAb和L的各種形式。
mAb和L的濃度數(shù)據(jù)一般用來在藥物開發(fā)的不同階段幫助做出具體的決策。在臨床前研究中，可能沒有相關(guān)試劑用于開發(fā)定量mAbfree的方法。mAbfree和mAbtotal（當沒有檢測mAbfree的方法時）的定量數(shù)據(jù)將用于評估系統(tǒng)暴露量-時間過程與毒性研究結(jié)果的關(guān)系，并預(yù)測人體起始劑量的安全余量。通常情況下，mAb給藥的劑量會使得血液中mAb的濃度遠超L，因而mAbtotal與mAbfree相近并可以作為mAb活性的指標，進而基于PK-PD模型計算來決定采用多大劑量。
在臨床評估中，會使用特定試劑測定mAbfree或mAbtotal以描述mAb藥物在人體中的分布情況，并將mAb的暴露量與其安全性和有效性聯(lián)系起來。同時，也有助于更好地理解mAb-L的動力學，為后期臨床研究時選擇給藥方案提供相關(guān)信息。
在藥物開發(fā)中，越來越多的研究人員選擇使用靶標配體（L）的濃度數(shù)據(jù)來指導決策。例如，Lfree的數(shù)據(jù)可用于指導給藥劑量和頻率的選擇。對L動力學的理解有助于確定維持受體占用率所需的mAbfree的有效濃度。在許多情況下，由于Lfree的濃度很低，并且可能隨分析條件的變化而變化，定量數(shù)據(jù)可能是不可靠的。
另一種方法是考查給藥后Lfree的變化趨勢，而不是依賴其絕對值。Ltotal提供了mAb活性的證據(jù)，此外，如果mAb–L的結(jié)合改變了靶點表達量(例如L的高度積累)，可能需要提醒研究人員注意安全性的問題。可以在PK/PD模型中，使用Ltotal來推斷Lfree的濃度。根據(jù)Ltotal、Lfree以及mAbfree或者mAbtotal的適當信息，通過PK/PD建模來估計Lfree的體內(nèi)結(jié)合親和力和抑制作用，這可能有助于給藥劑量和頻率的選擇。
由于待測物的形態(tài)(游離/總/復(fù)合，free/total/complex)和用于定量這些形態(tài)的生物分析方法會影響藥物暴露量-時間過程的確定，因此在整個藥物開發(fā)計劃的背景下，對生物分析數(shù)據(jù)的解釋保持一致是至關(guān)重要的。
此外，設(shè)計能夠解決相關(guān)科學問題的生物分析方法也很重要。由于每個靶標及其相關(guān)疾病生物學的復(fù)雜性和獨特性，應(yīng)與數(shù)據(jù)的最終用戶協(xié)商，為每個藥物開發(fā)項目精心制定定量相關(guān)形式的生物分析策略，并考慮藥物靶標生物學、藥物開發(fā)階段和包括試劑可及性在內(nèi)的實際挑戰(zhàn)。當前滿足所有要求且令人滿意的生物分析方法少之又少，還需要更多的努力來開發(fā)相關(guān)方法，所以目前大多數(shù)情況下只能使用不太理想的分析方法來支持藥物開發(fā)的某個階段。在這種情況下，應(yīng)該清楚地向所有利益攸關(guān)方傳達使用不太理想的分析方法時的注意事項、對數(shù)據(jù)的影響和項目的相關(guān)風險，以確保做出恰當?shù)臎Q策。
在一些文獻中，有些學者使用串聯(lián)高效色譜-質(zhì)譜(LC-MS/MS)方法來定量mAb。此種方法涉及酶消化，將mAb轉(zhuǎn)化成小的肽段（以保持在一定的質(zhì)荷比范圍內(nèi)）。需要注意的是，mAb必須在酶消化前變性，確保mAb與L的分離。因此，LC-MS/MS方法可用于定量mAbtotal。用于蛋白質(zhì)定量的LC-MS/MS方法將在后續(xù)文章中探討。
雖然本文所述的問題和例子可適用于多種類型的生物藥，但為了明確起見，本文重點關(guān)注的是mAb及其相關(guān)的靶標配體L。對于其它生物藥的復(fù)雜性，如蛋白質(zhì)、肽和寡核苷酸及其相互作用，還需要進一步考慮擴展這里提出的概念，并在未來探討。
就實際的分析方法開發(fā)和結(jié)果數(shù)據(jù)的適當運用而言，提出明確和果斷的建議是一個巨大的挑戰(zhàn)。本文試圖確定在藥物開發(fā)的每個階段數(shù)據(jù)的合用性，以便開發(fā)可以用于特定目的的定量分析方法。更重要的是強調(diào)了分析方法的局限性（對于適當?shù)亟忉尯褪褂脭?shù)據(jù)而言）。后續(xù)有機會將繼續(xù)探討mAbs和非mAbs生物藥的相關(guān)問題和挑戰(zhàn)，如結(jié)合mAb的抗藥物抗體（ADA），敬請關(guān)注。
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