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上周，“袁來如此”專欄根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)資料，對(duì)臨床免疫原性的評(píng)估作初步介紹（袁來如此 | 蛋白質(zhì)和多肽藥物臨床免疫原性的評(píng)估和報(bào)告（1_上）：基本概念和臨床相關(guān)性 ）。本期將延續(xù)上期內(nèi)容，重點(diǎn)就確定ADA免疫反應(yīng)的特征以及ADA臨床相關(guān)性分析等方面進(jìn)行探討。 本期內(nèi)容是《袁來如此》專欄的最后一期，感謝各位讀者對(duì)本欄目的關(guān)注與支持！未來博濟(jì)醫(yī)藥將繼續(xù)在相關(guān)學(xué)術(shù)領(lǐng)域深耕，適時(shí)推出科普學(xué)術(shù)專欄，敬請(qǐng)期待！ 確定ADA免疫反應(yīng)的特征 對(duì)臨床免疫原性解釋的一個(gè)基本指標(biāo)是ADA在該研究中或在可比較的所有同類研究中的發(fā)生率。經(jīng)過驗(yàn)證的ADA測試方法將樣品表征為ADA陽性和陰性。此外，當(dāng)使用易受藥物干擾的檢測方法時(shí)，建議將含有藥物干擾的樣品劃定為第三類—ADA-無結(jié)論。早先的文獻(xiàn)中最初建議，此類樣品應(yīng)報(bào)告為“陰性，但可能有藥物干擾”，其目的是想表達(dá)：此類樣本的ADA狀況未確定或測試結(jié)果可能不準(zhǔn)確。然而，新的生物分析技術(shù)和樣品預(yù)處理步驟（例如，酸分離），經(jīng)過仔細(xì)優(yōu)化和驗(yàn)證，是能夠提供準(zhǔn)確結(jié)果的，這應(yīng)該會(huì)幫助減少ADA無結(jié)論的樣品。ADA的生物分析策略和技術(shù)細(xì)節(jié)不在本文討論的范圍之內(nèi)，但后續(xù)"生物分析注意事項(xiàng)"中簡短地討論了可能影響免疫原性結(jié)果的方法學(xué)問題。 首先，需要根據(jù)體外測試方法得出的數(shù)據(jù)對(duì)受試者的ADA狀態(tài)進(jìn)行分類，建議根據(jù)以下定義對(duì)受試者的每個(gè)樣本進(jìn)行分類（“樣本ADA狀態(tài)”）： • ADA 陽性樣本：當(dāng)在樣本中檢測到 ADA ，該樣本被視為陽性。 • ADA 陰性樣本：當(dāng)未檢測到 ADA 且同一樣本中藥物不存在或即便存在，但具有已被證明不會(huì)干擾ADA檢測的水平，則該樣本被視為陰性。 • ADA 無結(jié)論樣本：當(dāng)未檢測到 ADA ，但樣本中存在藥物，其水平可能干擾 ADA 的檢測方法，則不能無可爭議地確認(rèn)該樣本為陰性，最好將其歸類為 ADA-無結(jié)論樣本。 • 不可測評(píng)樣品：樣品由于樣品量不足、處理不當(dāng)或樣品收集、處理、儲(chǔ)存等錯(cuò)誤而無法測試 ADA 狀態(tài)（“未檢測的樣品”）的樣品。 需要對(duì)上述定義作出以下澄清：“檢測到”意味著藥物分子特定的ADA得到確認(rèn)（confirmed）。此外，測定的“藥物耐受性”（不干擾ADA檢測方法的最高藥物濃度）并不是一個(gè)絕對(duì)數(shù)值，因?yàn)槊總€(gè)受試者之間會(huì)有所不同（由于ADA引起免疫反應(yīng)的親合性不同）。眾所周知，人體的免疫反應(yīng)因受試者而異，并且檢測中所使用的陽性對(duì)照品的性質(zhì)也不能外推到臨床樣本中去。但是，目前實(shí)用的方法也只是使用一個(gè)或多個(gè)ADA陽性對(duì)照品來開發(fā)檢測方法。這樣開發(fā)的方法能夠耐受高于預(yù)期最高的血液藥物濃度，而不至于受到藥物的干擾。 因此，制藥廠家可以考慮采取保守的方法，例如將ADA檢測方法的藥物耐受水平提高到ADA樣本中預(yù)期藥物濃度峰值的兩倍。同時(shí)，在可行的情況下，在預(yù)期血藥濃度最低（低谷濃度，trough concentrations）或處于藥物“洗凈washed out”階段來采集ADA樣品，這樣的取樣策略可以更準(zhǔn)確地檢測ADA。值得注意的是，用“邊界陽性（borderline positive）”一詞來描述具有位于檢測切點(diǎn)（assay cut point）上方的陽性結(jié)果的樣本（經(jīng)確認(rèn)存在ADA）是不合適的，這些是陽性樣本，其滴度至少等于檢測方法所需的最小稀釋度（MRD）。 其次，根據(jù)樣本的ADA狀態(tài)，建議使用以下定義確定每個(gè)受試者的治療-免疫原性顯現(xiàn)的狀態(tài)（受試者ADA狀態(tài)）： •可評(píng)估受試者：該受試者在治療或后續(xù)觀察期間至少獲取了一個(gè)適合做ADA檢測的樣本（有可報(bào)告結(jié)果）。只有可評(píng)估受試者會(huì)用于計(jì)算治療引起ADA的發(fā)生率。建議在適合檢測抗體的時(shí)間點(diǎn)采集樣本，如"采樣"部分所述。 •不可評(píng)估受試者：在治療或后續(xù)觀察期間，服用藥物后一個(gè)樣本也沒有采集到（或者沒有可報(bào)告的結(jié)果）的受試者。然而，雖然該受試者被排除在治療-免疫原性顯現(xiàn)的分析之外，但如果基線樣本有可報(bào)告的結(jié)果，則該受試者應(yīng)納入預(yù)先存在ADA的人數(shù)中。另一方面，如果一個(gè)不可評(píng)估受試者的所有樣本都無法評(píng)估或沒有可報(bào)告的結(jié)果，那么該受試者就不參與任何免疫原性分析。 •ADA陽性受試者：在治療或后續(xù)觀察期間的任何時(shí)間取樣，至少有一個(gè)治療引起或治療增強(qiáng)的 ADA 陽性的樣本。 •ADA陰性受試者：在治療或后續(xù)觀察期間的任何時(shí)間取樣，沒有一個(gè)治療引起或治療增強(qiáng)的 ADA 陽性的樣本。 •ADA無結(jié)論受試者：不能無可辯駁地歸類為 ADA 陰性的受試者。為此類別建立一個(gè)單一的定義是不可行的：因?yàn)閷?duì)于不同類別的產(chǎn)品和不同情況，存在多種可能的原因?qū)е逻@種狀況。因此，在開發(fā)生物藥時(shí)，應(yīng)將藥物的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)的概況、先前使用該藥物的經(jīng)驗(yàn)、同類藥物的標(biāo)簽信息或相關(guān)文獻(xiàn)和/或與監(jiān)管機(jī)構(gòu)的討論等，全面納入考慮和評(píng)估，以便對(duì)ADA無結(jié)論受試者定義一個(gè)合用（fit-for-purpose）的類別。 例如： a.盡管在受試者使用某個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)藥物治療期間（包括隨訪觀察期）觀察到一些ADA陰性樣本，但其他多個(gè)樣本都屬于無結(jié)論樣本，以致無法對(duì)受試者的ADA狀態(tài)得出明確結(jié)論。 b.盡管在受試者使用低風(fēng)險(xiǎn)藥物治療期間（包括隨訪觀察期）的所有樣本都是ADA陰性，但最后一個(gè)可評(píng)估樣本是個(gè)無結(jié)論樣本。因此，保守的說法就是這個(gè)受試者是ADA無結(jié)論受試者。當(dāng)然，如果不這樣判定，就應(yīng)當(dāng)提出合理的科學(xué)證據(jù)。 將對(duì)ADA檢測呈陰性，但能檢測到藥物（或其濃度在該方法的藥耐限量之上）的樣本判定為ADA-無結(jié)論樣本可能是一個(gè)存在爭議的問題。普遍持有的觀點(diǎn)是：ADA樣本檢測的結(jié)果應(yīng)“按原樣”報(bào)告，即僅有陽性或陰性這兩種結(jié)果，這些結(jié)果可根據(jù)其它測試（如PK和PD）的結(jié)果加以審視；如果對(duì)ADA陰性結(jié)果的懷疑有進(jìn)一步的證據(jù)（基于其它檢測），則需要進(jìn)一步解釋。但是，此方法假定進(jìn)行其他適當(dāng)?shù)臏y試，即它們能夠容忍ADA的存在，并且有足夠的敏感性和選擇性，因而足以證明ADA的效果。 可能出現(xiàn)的另一個(gè)有爭議的問題是：ADA無結(jié)論受試者是否應(yīng)包括在具有ADA結(jié)果（報(bào)告為ADA陽性或陰性的比例）的受試者總數(shù)（分母）中。 另一種觀點(diǎn)認(rèn)為，ADA無結(jié)論受試者不應(yīng)包括在分母中，因?yàn)?amp;ldquo;藥物不耐受”的ADA檢測方法會(huì)報(bào)告假陰性數(shù)據(jù)。另一方面，如果ADA無結(jié)論受試者只占被評(píng)估受試者的一小部分，免疫原性風(fēng)險(xiǎn)被認(rèn)為較低，或因?yàn)闊o法完全地確信所測定的“藥物耐受性”（因其不是一個(gè)很準(zhǔn)確的限度），則包括這些受試者是可以接受的。例如，在某些腫瘤藥物研究中，包括 ADA-無結(jié)論受試者可能是合理的，這些研究通常使用高劑量的藥物（導(dǎo)致藥物的血清低谷濃度的水平較高），藥物洗凈期（washout periods）也常常無法實(shí)現(xiàn)。 如果是這樣做的話，就應(yīng)該在藥品標(biāo)簽上清楚地解釋相關(guān)注意事項(xiàng)。無論做何決策，都應(yīng)該對(duì) ADA 檢測方法與其藥物容忍限度有良好的理解，使用多個(gè) ADA 陽性對(duì)照，使用來自正交的檢測方法或技術(shù)的支持性數(shù)據(jù)，與相關(guān)醫(yī)藥監(jiān)管機(jī)構(gòu)進(jìn)行協(xié)商。 最后，值得注意的是，在臨床研究設(shè)計(jì)中，一個(gè)重要的考慮因素是建立一個(gè)采樣策略，即在預(yù)期藥物濃度最低（低谷濃度）或消除階段（藥物洗出）時(shí)采集樣本，以增加準(zhǔn)確檢測到和正確報(bào)告 ADA 的可能性。在將受試者及其樣本分成上述“ADA狀態(tài)”的類別之后，建議從不同角度對(duì)組合數(shù)據(jù)集進(jìn)行詳細(xì)評(píng)估。如果樣本大小允許，也應(yīng)該按每個(gè)相關(guān)變量，如：劑量、給藥頻率、給藥途徑、給藥次數(shù)、藥物暴露天數(shù)（每天注射一次或多次藥物）、同時(shí)用藥（特別是免疫調(diào)節(jié)劑）等等，進(jìn)行分析。ADA臨床相關(guān)性分析 評(píng)估ADA陽性樣本的臨床相關(guān)性的第一步是以不同的方式將數(shù)據(jù)可視化?？梢暦治龅某潭葘⑷Q于藥物所處的開發(fā)階段、樣本數(shù)量和ADA發(fā)生率（ADA陽性受試者越多，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)相關(guān)性或?qū)?amp;ldquo;趨勢”的判斷更可能是有價(jià)值的）。因此，數(shù)據(jù)分析的類型和范圍應(yīng)以合理的科學(xué)判斷與相關(guān)醫(yī)藥監(jiān)管機(jī)構(gòu)的協(xié)商為出發(fā)點(diǎn)和動(dòng)力。一些有價(jià)值的ADA 屬性分析類型如下: • 預(yù)先存在的ADA、滴度和增強(qiáng)（boosting）： -基線ADA陽性受試者占其基線樣本的受試者總數(shù)（經(jīng)ADA測試，有可報(bào)告的結(jié)果）的百分比； -基線ADA陽性樣本的滴度范圍（中位和四分位數(shù)[IQR]范圍）； -服用生物藥后ADA陽性基線受試者中ADA陽性受試者顯著增加的百分比：即在初始給藥后，采集到的任何一個(gè)樣本具有ADA滴度，并且該滴度以科學(xué)上合理的幅度，如4倍或9倍，超越基線滴度。 • ADA發(fā)生率和滴度： -ADA總體發(fā)生率：治療增強(qiáng)和治療引起ADA陽性受試者的總和，除以可評(píng)估受試者的總數(shù)，而得出的百分比。不包括給藥后沒有任何樣本供評(píng)估，基線陽性的受試者。 -治療引起的ADA發(fā)生率：治療引起ADA陽性受試者總數(shù)，除以可評(píng)估的，基線ADA陰性的受試者總數(shù)，而得出的百分比。此外，需要報(bào)告此組受試者滴度的峰值和范圍（中位數(shù)、IQR）。 •中和性ADA：如果適用的話，按上文所述分析報(bào)告預(yù)先存在的NAb、增強(qiáng)和發(fā)生率。如果ADA在所有受試者中都是中和性ADA，則無需作單獨(dú)的分析。 •ADA動(dòng)力學(xué)：ADA出現(xiàn)的時(shí)機(jī)及其持續(xù)時(shí)間對(duì)于臨床醫(yī)生監(jiān)測治療的進(jìn)展非常有用?？贵w的持續(xù)性在幾個(gè)病例中顯示與臨床效應(yīng)相關(guān)聯(lián)。 對(duì)藥物開發(fā)人員而言，關(guān)于ADA動(dòng)力學(xué)知識(shí)有助于優(yōu)化同一生物藥后續(xù)研究中的采樣計(jì)劃，以及作為藥物上市后藥物警戒計(jì)劃的一部分，助力ADA監(jiān)測計(jì)劃的優(yōu)化、風(fēng)險(xiǎn)的管理和緩解。 ADA動(dòng)力學(xué)的圖像表示是最有用的。例如，圖1中說明了ADA開始和ADA持續(xù)時(shí)間的雙變量圖；圖2中所示為瞬時(shí)態(tài)與持續(xù)性ADA頻率圖。當(dāng)ADA陽性受試者數(shù)量較多（例如≥20），并且研究持續(xù)時(shí)間足夠長，足以識(shí)別其發(fā)育后持久性抗體（例如≥1年）時(shí)，這些類型的圖表蘊(yùn)含的信息最豐富。 圖1.治療引起的ADA動(dòng)力學(xué): 發(fā)生和持續(xù)時(shí)間。ADA陽性結(jié)果持續(xù)時(shí)間與ADA發(fā)生時(shí)間的示意圖。垂直和水平網(wǎng)格線繪制在分布的四分位數(shù)處：這有助于確定ADA的持續(xù)性或瞬時(shí)性是否與在患者中觀察到ADA的時(shí)間相關(guān)。為了保證評(píng)估的準(zhǔn)確性，只有那些ADA始發(fā)時(shí)間是上次訪問前至少16周，或者在上次訪問時(shí)或之前是ADA陰性的患者，才應(yīng)列入此圖。在解釋此示意圖時(shí)，應(yīng)牢記在較晚的ADA始發(fā)時(shí)間的最大持續(xù)時(shí)間將按比例減少。圖中的符號(hào)可以指示所選擇的變量（本例中是劑量），臨床效應(yīng)，如：對(duì)療效的影響（例如：是，否，和研究中斷），不良反應(yīng)（例如：是，否，和研究中斷）等。 當(dāng)樣本量足夠大時(shí)，還建議對(duì)結(jié)果進(jìn)行更多的統(tǒng)計(jì)描述。這種客觀的方法可以防止由于主觀偏見而曲解結(jié)果。但值得注意的是，對(duì)于樣本量大小的評(píng)估應(yīng)根據(jù)具體情況判斷，也要取決于臨床研究的設(shè)計(jì)。建議采用以下計(jì)算方法： （a）ADA的始發(fā)（Onset）：指在研究中初次給藥到發(fā)現(xiàn)第一例治療引起ADA的時(shí)間段。使用實(shí)際經(jīng)過的時(shí)間是計(jì)算該時(shí)間段的理想選擇，不過使用最初設(shè)定的研究時(shí)間段也是可行的。計(jì)算“ADA 出現(xiàn)的時(shí)間中位值（median time to ADAdevelopment）”和四分位數(shù) Q1 和 Q3，可以分別用來解釋50%、25%和75%的ADA陽性受試者的ADA始發(fā)時(shí)間。分析ADA始發(fā)相關(guān)的其他參數(shù)可以是：“到ADA始發(fā)的給藥次數(shù)"或 "到ADA始發(fā)的藥物暴露天數(shù)”。 （b）ADA的持續(xù)時(shí)間：指藥物引起的ADA的壽命。計(jì)算和報(bào)告誘導(dǎo)發(fā)生的ADA響應(yīng)的中位持續(xù)時(shí)間和IQR，對(duì)于評(píng)估其與臨床效果的相關(guān)性，是最客觀的方法。但粗略地將 ADA 分類為瞬時(shí)性與持續(xù)性的方法占主導(dǎo)地位。雖然沒有必要使用此類術(shù)語進(jìn)行分類，但在應(yīng)用這些術(shù)語時(shí)，使用統(tǒng)一定義就變得非常重要了。因?yàn)樘烊唬▋?nèi)源性）的人類IgG1，IgG2和IgG4的半衰期大約在21-25天左右，五個(gè)半衰期大約等于16周。如果ADA只被藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生，并且從未被重新刺激或增強(qiáng)（一種"瞬時(shí)態(tài)"抗體），它將受人體的天然清除機(jī)制的約束。因此，ADA預(yù)計(jì)將在五個(gè)半衰期之后被完全清除（實(shí)際上只剩下微不足道的3%）。因此，可以用此現(xiàn)象區(qū)分瞬時(shí)性（血清返還sero-reverting）與持續(xù)性ADA，并建議用以下方法來評(píng)估ADA的持續(xù)時(shí)間: • 瞬時(shí)性 ADA 響應(yīng)： –藥物治療引起的ADA在治療或后續(xù)觀察期間只在一個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)檢測到（不包括最后一個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)，除非在之后被證明無法檢測到），否則應(yīng)視為持續(xù)性的，或： –藥物治療引起的ADA在治療期間（包括隨訪期，如果有的話）有兩個(gè)或兩個(gè)以上采樣時(shí)間點(diǎn)被檢測到，其中第一個(gè)和最后一個(gè)ADA陽性樣本（無論中間有任何陰性樣本）是小于16周的時(shí)間段間隔，并且受試者在最后一個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)是ADA陰性。 • 持續(xù)性 ADA 響應(yīng)： –藥物治療引起的ADA在治療期間（包括隨訪期）有兩個(gè)或兩個(gè)以上采樣時(shí)間點(diǎn)被檢測到，其中第一個(gè)和最后一個(gè)ADA陽性樣本（無論中間有任何陰性樣本）間隔有16周或更長，或： –藥物治療引起的ADA發(fā)生率僅在治療研究期的最后一個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)，或者與上一個(gè)ADA陰性的間隔不到16周的采樣時(shí)間點(diǎn)。雖然很少見，但如果IgG3或IgA的ADA在研究人群中占主導(dǎo)地位，則應(yīng)用5周（而不是16周）的時(shí)間段來修改瞬時(shí)性和持續(xù)性ADA的定義。這是因?yàn)镮gG3和IgA的半衰期比其他IgG短（IgG3為7天，IgM和IgA為5天）。 請(qǐng)注意，治療增強(qiáng)的ADA被排除在ADA動(dòng)力學(xué)分析之外，因?yàn)檫@種類型的免疫反應(yīng)在機(jī)制上有所不同。在預(yù)先存在的ADA非常普遍的情況下，單獨(dú)描述增強(qiáng)ADA的動(dòng)力學(xué)可能很有用。這時(shí)，無需將ADA響應(yīng)分為瞬時(shí)性（transient）和持續(xù)性響應(yīng)。計(jì)算ADA的中位持續(xù)時(shí)間和四分位數(shù)（Q1和Q3）后就可以分別描述50%、25%和75%的ADA陽性受試者的ADA持續(xù)時(shí)間。四分位數(shù)方法可以更好地闡明ADA持續(xù)時(shí)間與臨床效應(yīng)之間的關(guān)系（如果有的話）。最后一點(diǎn)，將瞬時(shí)性和持續(xù)性抗體分別定義為在研究結(jié)束前消失和在最后研究時(shí)間點(diǎn)仍然存在的抗體，是不太合適的，這是因?yàn)樗矔r(shí)性和持續(xù)性ADA的定義將取決于臨床研究的長度，而并非ADA實(shí)際持續(xù)的時(shí)間。如果使用這樣的定義，較長的臨床研究會(huì)將ADA的性質(zhì)偏頗地判斷為"瞬時(shí)性抗體"。 • NAb 發(fā)生率和動(dòng)力學(xué)： 當(dāng)研究結(jié)果表明：受試者可以根據(jù)他們是否擁有NAb與non-NAb 而分組時(shí)，可以運(yùn)用上文所述方式，分別詳細(xì)考察每個(gè)組NAb的發(fā)生率和動(dòng)力學(xué)。 • 交叉反應(yīng)性： 當(dāng)生物藥物分子與內(nèi)源性蛋白（全部或部分）相同或幾乎相同時(shí)，評(píng)估ADA與內(nèi)源性蛋白的交叉反應(yīng)性非常重要，因?yàn)槿藗冊(cè)絹碓綋?dān)心這種ADA可能導(dǎo)致以內(nèi)源性蛋白質(zhì)耗盡為特征的自身免疫性綜合征。將具有交叉反應(yīng)性的ADA和對(duì)藥物分子的ADA滴度和動(dòng)力學(xué)進(jìn)行比較會(huì)有助于評(píng)估相關(guān)疾病的惡化。 圖2.治療引起的ADA發(fā)生動(dòng)力學(xué): 一個(gè)研究實(shí)例中的瞬時(shí)和持續(xù)ADA免疫反應(yīng)的發(fā)展。每一點(diǎn)表示在所示發(fā)病時(shí)間出現(xiàn)ADA的受試者的百分比，其持續(xù)時(shí)間可能是短暫的或持久的。在此示例中，10%的受試者有 2個(gè)月的ADA始發(fā)時(shí)間，其中4%具有瞬時(shí)性ADA響應(yīng)，6%具有持續(xù)性 ADA響應(yīng)。類似的，在6個(gè)月的ADA始發(fā)時(shí)間，0.5%有瞬態(tài)ADA響應(yīng)，5.5%有持續(xù)的ADA響應(yīng)。該圖的橫軸也可以使用劑量。 可以使用替代方法描述這些ADA的屬性。但是需注意的是，主觀性的術(shù)語應(yīng)該避免，因?yàn)樗鼈兛赡鼙诲e(cuò)誤地解釋為暗示與臨床效應(yīng)某種程度的關(guān)聯(lián)性。例如，ADA陽性人群的滴度可以報(bào)告為中位數(shù)和四分位數(shù)范圍（IQR），但不宜使用諸如“高”或“低”等詞語，因?yàn)槿藗兛赡苠e(cuò)誤地認(rèn)為高滴度的抗體與臨床效應(yīng)相關(guān)（即引起不良事件），而低滴度的抗體則不會(huì)（即良性）。 圖3.ADA滴度動(dòng)力學(xué)。研究中隨時(shí)間變化的這種滴度圖有助于確定ADA水平在治療過程中是否隨時(shí)間而變化。每個(gè)框圖表示滴度范圍、Q1、中位數(shù)（Q2）、Q3，不包括異常值（星標(biāo)）。 ADA數(shù)據(jù)可以酌情以表格、文本或圖像等形式顯示。其中，以表格形式提供原始數(shù)據(jù)可以幫助監(jiān)管機(jī)構(gòu)能夠進(jìn)行獨(dú)立的分析，以驗(yàn)證所提交的結(jié)果。當(dāng)在表格中提供樣本分析結(jié)果時(shí)，最好包括：受試者識(shí)別號(hào)、臨床站點(diǎn)識(shí)別號(hào)（姓名或編號(hào)）、計(jì)劃的隨訪或給藥訪問（預(yù)定時(shí)間點(diǎn)）、給藥劑量/頻率、樣本采集日期（實(shí)際時(shí)間點(diǎn)）、測定的藥物血清濃度、樣本ADA的狀態(tài)和滴度、中和能力狀態(tài)等。ADA陽性受試者數(shù)量很少的研究可能會(huì)限制某些數(shù)據(jù)分析的進(jìn)行?？偨Y(jié)與前瞻 此文為本《蛋白質(zhì)和多肽藥物臨床免疫原性的評(píng)估和報(bào)告》系列的第一篇，包含相關(guān)定義和術(shù)語、ADA免疫反應(yīng)的特點(diǎn)以及其臨床相關(guān)性分析。后續(xù)文章將涉及ADA狀態(tài)與PK/PD，臨床安全性和療效的關(guān)系。 特別聲明本文如有疏漏和誤讀相關(guān)指南和數(shù)據(jù)的地方，請(qǐng)讀者評(píng)論和指正。所有引用的原始信息和資料均來自已經(jīng)發(fā)表學(xué)術(shù)期刊、官方網(wǎng)絡(luò)報(bào)道等公開渠道，不涉及任何保密信息。參考文獻(xiàn)的選擇考慮到多樣化但也不可能完備。歡迎讀者提供有價(jià)值的文獻(xiàn)及其評(píng)估。 參 考 文 獻(xiàn) 1. Guidance for industry: immunogenicityassessment for therapeutic protein products. In: U.S. Department of Health andHuman Services (DHHS), Food and Drug Administration (FDA), Center for DrugEvaluation and Research (CDER), Center for Biologics Evaluation and Research(CBER).http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM338856.pdf2013.Accessed 18 Mar 2014.2. Shankar G, et al. Assessment andreporting of the clinical immunogenicity of therapeutic proteins and peptides –harmonized terminology and tactical recommendations. AAPS J. 16(4), 658–673(2014). 3. Mire-Sluis AR, et al.immunoassays used in the detection ofhost antibodies against biotechnology products. J. Immunol. Methods 289, 1–16 (2004). 4. Shankar G, et al. Recommendations forthe validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnologyproducts. J. Pharm. Biomed. Anal. 48(5), 1267–81 (2008). 5. Smith HW, Moxness M, Marsden R. 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2021-09-13
本期《袁來如此》為系列文章《蛋白質(zhì)和多肽藥物臨床免疫原性的評(píng)估和報(bào)告》的第一篇，旨在根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)資料，對(duì)臨床免疫原性的評(píng)估作初步介紹，包含相關(guān)定義和術(shù)語、ADA免疫反應(yīng)的特點(diǎn)及其臨床相關(guān)性分析。 由于內(nèi)容篇幅較長，本文將采取上下篇形式進(jìn)行推送，《袁來如此》系廣州博濟(jì)醫(yī)藥微信公眾號(hào)打造的科普學(xué)術(shù)專欄，敬請(qǐng)垂注！ 評(píng)估生物藥的免疫原性是開發(fā)生物藥過程中的一個(gè)重大關(guān)注點(diǎn)，因?yàn)樗鼤?huì)影響生物藥的安全性和有效性。迄今為止，文獻(xiàn)中對(duì)藥品免疫原性的描述各不相同，這一方面是因?yàn)閷W(xué)者們對(duì)藥品免疫原性的理解程度隨時(shí)間在不斷加深，另一方面要?dú)w結(jié)為該領(lǐng)域?qū)I(yè)詞匯不斷演變?cè)斐闪艘欢ǖ幕靵y。慶幸的是，隨著近年來業(yè)界對(duì)于評(píng)估藥品免疫原性所需的數(shù)據(jù)日益達(dá)成了共識(shí)，相對(duì)統(tǒng)一的表述也逐步形成。 描述抗藥物抗體（ADA）的發(fā)生率、動(dòng)力學(xué)和強(qiáng)度、中和能力、與內(nèi)源性分子或其他上市生物藥的交叉反應(yīng)以及相關(guān)的臨床影響，可加強(qiáng)對(duì)使用這些生物藥的患者的護(hù)理。為此，需要對(duì)描述和分析臨床免疫原性數(shù)據(jù)的術(shù)語和定義、呈現(xiàn)數(shù)據(jù)的方法、ADA的出現(xiàn)/發(fā)展與藥代動(dòng)力學(xué)、療效和安全性的關(guān)聯(lián)等評(píng)估免疫原性的臨床相關(guān)性所必需的工具做一個(gè)梳理。導(dǎo)論 蛋白質(zhì)藥物（也稱為生物制劑、生物藥或生物制品）和多肽具有誘發(fā)免疫原性的潛力，本文中稱此類別的藥物為“生物藥”。在傳統(tǒng)意義上，多肽雖然不被認(rèn)為是生物制劑或蛋白質(zhì)藥物，但仍可能具有類似于蛋白質(zhì)的免疫原性。美國和歐洲監(jiān)管機(jī)構(gòu)目前將多肽區(qū)分為重組（生物）實(shí)體與合成（化學(xué)）實(shí)體，要求分別提交不同的生物制劑許可證申請(qǐng)（BLA）/營銷授權(quán)申請(qǐng)（MAA）。 具有免疫原性的藥物能造成的臨床后果各不相同，沒有任何臨床效果或者嚴(yán)重、危及生命的反應(yīng)都有可能發(fā)生?？顾幬锟贵w（ADA）可引起輸液反應(yīng)（infusion reactions）、過敏反應(yīng)（anaphylaxis）以及免疫復(fù)合物（immune complex）介導(dǎo)的疾病，ADA還導(dǎo)致次級(jí)治療失?。疮熜У膿p失），在極少數(shù)情況下，還可能引起更嚴(yán)重的不良事件，如缺乏綜合征（deficiency syndromes），例如血小板減少癥（thrombocytopenia）和純紅細(xì)胞發(fā)育不全（pure red cell aplasia）。因此，ADA是一個(gè)涉及生物藥的安全性和長期療效的醫(yī)學(xué)難題，在臨床研究期間評(píng)估患者ADA的出現(xiàn)和發(fā)展十分關(guān)鍵，而且并不能單純只是以臨床癥狀為關(guān)注點(diǎn)，需要密切關(guān)注和評(píng)估ADA的產(chǎn)生和發(fā)展的機(jī)制性問題。因此，闡明ADA響應(yīng)及其臨床特點(diǎn)與其造成的相關(guān)后果，借以指導(dǎo)醫(yī)療實(shí)踐，是至關(guān)重要的。 近年來行業(yè)界已經(jīng)開發(fā)出各種方法來降低蛋白分子的免疫原性，包括使用全人類蛋白質(zhì)序列、修改已知或預(yù)期的免疫原顯性表位、使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)生產(chǎn)藥物、實(shí)施先進(jìn)的生產(chǎn)方法和分析表征技術(shù)。但是，人類免疫系統(tǒng)仍然可以感知來自生物藥的“異質(zhì)性/非自我性”或“危險(xiǎn)信號(hào)/自身壓力”等因素，從而對(duì)生物藥產(chǎn)生特定的免疫反應(yīng)。 事實(shí)上，大多數(shù)已批準(zhǔn)上市的生物藥物都是免疫原，ADA的發(fā)生率可以達(dá)到90%以上。更重要的是，ADA及其臨床后遺癥的發(fā)生率在同類產(chǎn)品之間以及患者群體之間可能有很大差異，這妨礙了對(duì)免疫原性的預(yù)測。所以，我們必須在臨床研究時(shí)加以監(jiān)測。這種差異可能是由于使用不同的生物分析方法、數(shù)據(jù)解釋方法，以及大量產(chǎn)品特異和患者特異等因素所造成的。而使這一問題更加復(fù)雜的是，用于收集、分析和呈現(xiàn)免疫原性結(jié)果的術(shù)語和方法缺乏一致性和標(biāo)準(zhǔn)化。 生物藥標(biāo)簽或處方會(huì)在不同程度上描述臨床免疫原性，但往往只提到在關(guān)鍵的臨床Ⅲ期研究中ADA和中和性抗體（NAb）的總體發(fā)生率。這些有限的信息并不足以真正告知醫(yī)生和患者在臨床實(shí)踐中使用該藥物的真正收益與風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)ADA相關(guān)事件缺乏充分和一致的描述可能導(dǎo)致臨床醫(yī)生錯(cuò)誤地管理患者的用藥。 為了給患者提供最佳的治療計(jì)劃，有關(guān)免疫原性的具體信息可在如下情況下讓醫(yī)生受益：在啟動(dòng)治療方案時(shí)的安全性考量，在可接受的安全性前提下如何維持治療效果，以及提供在患者中出現(xiàn)ADA時(shí)如何應(yīng)對(duì)的選項(xiàng)。示例包括：在初次給藥或間歇性重新給藥時(shí)出現(xiàn)過敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)；在存在ADA的情況下，以實(shí)現(xiàn)治療效果為目標(biāo)的給藥策略，以及在何種情況下需要停止治療，或者評(píng)估切換到其他同類產(chǎn)品或具有不同作用機(jī)制的產(chǎn)品的后果。因此，產(chǎn)品標(biāo)簽需要描述ADA的發(fā)生率、程度、始發(fā)時(shí)間、持續(xù)時(shí)間、中和能力、與內(nèi)源性分子或其他上市生物藥的交叉反應(yīng)，以及其臨床相關(guān)閾值，以便在臨床上優(yōu)化使用該生物藥治病的療程。 因此，本文將探討與生物藥的免疫原性相關(guān)的，常用于產(chǎn)品免疫原性描述的術(shù)語和定義，數(shù)據(jù)分析和呈現(xiàn)方法，以及臨床醫(yī)生評(píng)估免疫原性的臨床相關(guān)性的指南，并且對(duì)臨床研究中評(píng)估ADA時(shí)所用的采樣模式以及相應(yīng)結(jié)果的解釋和呈現(xiàn)提出了具體建議。由于藥物開發(fā)階段或藥物警戒目標(biāo)以及對(duì)特定風(fēng)險(xiǎn)的具體評(píng)估不同，相關(guān)數(shù)據(jù)的分析和解釋也會(huì)有所不同，因此，上述建議將作為一般方法加以推薦，以增進(jìn)對(duì)免疫原性的理解，但這并非意味著能夠以其取代當(dāng)前的監(jiān)管指導(dǎo)文件、與衛(wèi)生機(jī)構(gòu)協(xié)商的結(jié)果、合理的科學(xué)判斷。定義和術(shù)語 在免疫原性研究中的常見定義或術(shù)語匯集如下： •生物藥：此術(shù)語指使用生物技術(shù)生產(chǎn)出的治療性蛋白藥物，包括單克隆抗體（mAbs）和多肽、一些血漿衍生產(chǎn)品（例如，凝固因子替代產(chǎn)品）和使用天然方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)（例如，治療性酶和毒素），但不包括：寡核苷酸、細(xì)胞產(chǎn)品和疫苗。生物藥包括多肽，無論是用何種方法，化學(xué)合成的或生物系統(tǒng)表達(dá)生產(chǎn)的，也無論目前監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)生物藥是如何定義的。 •抗藥物抗體（Anti-Drug Antibody，ADA）：能與生物藥反應(yīng)，結(jié)合的抗體，包括用藥前存在的宿主抗體（能與目前使用的生物藥發(fā)生交叉反應(yīng)的宿主抗體，稱為“基線ADA”）。它包括中和性的和非中性的ADA。等同于ADA的其他術(shù)語包括：抗治療抗體（Anti-Therapeutic Antibody，ATA），抗產(chǎn)物抗體（Anti-Product Antibody，APA），或抗生物抗體（Anti-Biologic Antibody，ABA）。 •藥物結(jié)合抗體（Binding ADA）：所有ADA本質(zhì)上都是“結(jié)合”抗體。因?yàn)?，它們都?jīng)體外測試的方法確定與生物藥分子結(jié)合。這個(gè)定義不涉及其在人體體內(nèi)活性的相關(guān)性，即這種結(jié)合是否產(chǎn)生臨床效應(yīng)。通常，濫用此術(shù)語的情況是僅將其應(yīng)用于非中和性抗體，而事實(shí)上，中和性抗體也屬于藥物結(jié)合抗體這一大類別。 •中和性ADA（NAb，Neutralizing ADA）：通過體外試驗(yàn)或動(dòng)物生物學(xué)方法確定的，能夠抑制或減少生物藥分子藥理活性的ADA，無論其人體臨床的相關(guān)性如何，即無論測試結(jié)果與受試者上的臨床效應(yīng)是否有關(guān)。 •非中和性ADA（non-neutralizingantibody，non-NAb）：ADA與生物藥分子結(jié)合，但不抑制其藥理活性（經(jīng)體外測試或基于動(dòng)物的生物學(xué)方法測定），無論其人體臨床的相關(guān)性如何，即無論測試結(jié)果與受試者上的臨床效應(yīng)是否有關(guān)。 •藥物維持性ADA響應(yīng)：能降低生物藥體內(nèi)清除率的ADA免疫響應(yīng)，該生藥物的半衰期在其與此ADA結(jié)合的狀態(tài)比在其未結(jié)合的狀態(tài)要更長（通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法判斷的）。與ADA結(jié)合后的藥物可能有藥理活性（與非中和性ADA，即non-NAb結(jié)合時(shí)），也可能沒有藥理活性（與中和性ADA，即NAb結(jié)合時(shí)）。 •藥物清除性ADA響應(yīng)：能增加藥物體內(nèi)清除率的ADA（NAb或non-NAb）免疫響應(yīng)（通過統(tǒng)計(jì)方法判斷），這里是ADA免疫響應(yīng)（不是ADA本身）被視為“清除性”的。這個(gè)和上一個(gè)定義描述了ADA對(duì)生物藥分子造成的某種后果，即該生物藥體內(nèi)清除率的變化。ADA對(duì)藥物清除率的影響涉及多層面的機(jī)制：循環(huán)中免疫復(fù)合物晶格（circulating immune complex lattice），補(bǔ)體結(jié)合，F(xiàn)c受體結(jié)合等。一般來說，除了藥物的正常清除途徑外，ADA與生物藥分子形成的免疫復(fù)合物是由reticuloendothelial system清除的。由于免疫復(fù)合物的大小取決于抗原和抗體的濃度，在某些情況下，ADA可能只在超過一定滴度閾值的情況下才會(huì)增加藥物體內(nèi)清除率。 •人抗鼠抗體（Human Anti-Murine Antibody，HAMA）：對(duì)存在于鼠源或人源化的mAb藥物分子上的鼠原表位的人類抗體。從字面上看，這個(gè)術(shù)語可以解釋為：對(duì)某個(gè)mAb藥物產(chǎn)生的ADA可能與其他含鼠序的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)。將含有鼠序的mAb藥物給予ADA陽性的患者可能會(huì)是一個(gè)問題。當(dāng)未確認(rèn)ADA與其他鼠源抗體有交叉反應(yīng)時(shí)，建議避免用HAMA代表對(duì)鼠源抗體藥物的ADA。 •人抗嵌合體抗體（Human Anti-Chimeric Antibody，HACA）：人類對(duì)存在于嵌合體mAb藥物分子中非人類表位（通常是：人+另一物種，通常是小鼠）產(chǎn)生的抗體。從字面上看，這個(gè)術(shù)語可以解釋為ADA可能與其他嵌合體抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，給ADA陽性受試者服用其他嵌合物抗體藥物可能會(huì)是一個(gè)問題。當(dāng)未確認(rèn)ADA與其他嵌合體抗體發(fā)生交叉反應(yīng)時(shí)，建議避免使用HACA代表對(duì)嵌合體mAb藥物的ADA。 •人抗人抗體（HAHA）：對(duì)存在于人源化的或完全人類的mAb藥物分子中的人/人源化的表位產(chǎn)生的ADA。從字面上看，這個(gè)術(shù)語可以解釋為該ADA可能與其他基于人類序列的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)。因此，給ADA陽性的受試者服用其他人類mAb藥物可能會(huì)是一個(gè)問題。當(dāng)未確認(rèn)ADA與其他基于人類序列的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)時(shí)，建議避免使用HAHA代表對(duì)人源或人mAb藥物的ADA。 •風(fēng)濕因子（RF）：一種內(nèi)源性免疫球蛋白，通常結(jié)合IgG的Fc部分。RF通常存在于患有自身免疫性疾?。ㄈ珙愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）患者的血清中。風(fēng)濕因子有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)在其他疾病患者，甚至健康個(gè)人的血清中，并可能干擾ADA檢測方法。 •預(yù)先存在的ADA：指在治療前（或臨床研究開始之前），受試者體內(nèi)存在的與生物藥反應(yīng)的抗體。此術(shù)語與“基線ADA”類似，嚴(yán)格地用于代表治療開始前檢測到的與藥物反應(yīng)的抗體，而不論這種反應(yīng)的起因（即無論患者是否在過去接受同一藥物，或因接觸其他藥物/抗原后，所產(chǎn)生的能交叉反應(yīng)的抗體）。 •治療引起的ADA：在服用生物藥之后產(chǎn)生的新ADA（血清轉(zhuǎn)化），即在沒有預(yù)先存在的ADA的受試者中，在最初服用藥物后的任何時(shí)間內(nèi)形成的ADA。 •治療增強(qiáng)的ADA：預(yù)先存在的ADA，在服用生物藥后被提升到更高水平。即在初始服用藥物后的任何時(shí)間內(nèi)，ADA的滴度以科學(xué)合理的倍數(shù)（如4倍或9倍）超出基線滴度。 •ADA流行率（prevalence:）：所有在任何時(shí)間點(diǎn)具有藥物反應(yīng)抗體（包括預(yù)先存在的抗體）的受試者與可以評(píng)估的人群的比值。此術(shù)語與 ADA 發(fā)生率不同（見下文）。 •ADA發(fā)生率（incidence）：在研究期間發(fā)現(xiàn)有血清轉(zhuǎn)化或增強(qiáng)其先前存在的ADA的研究人群的比例。是“治療-出現(xiàn)ADA”的同義詞，ADA發(fā)生率為治療引起的和因治療增強(qiáng)了的ADA陽性受試者的總和與可以評(píng)估的人群的比值。術(shù)語“ADA比率（rate）”不應(yīng)用于代表ADA發(fā)生率，因?yàn)?amp;ldquo;rate”通常意味著一個(gè)測量單位隨時(shí)間的變化，而"發(fā)生率"是測量單位與相關(guān)單位總?cè)后w的比值。此術(shù)語與 ADA 流行率不同（見上文）。 •滴度（titer）：樣本中ADA水平的準(zhǔn)定量表達(dá)。通過采用基于連續(xù)倍比稀釋的測試方法，滴度被定義為樣品（包括MRD，最低稀釋度）產(chǎn)生陽性結(jié)果（即高于預(yù)定的“切點(diǎn)”值的結(jié)果）的最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)，例如，稀釋1/100=滴度為100。滴度也可以在用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后呈現(xiàn)。或者在切點(diǎn)值處，通過從稀釋曲線插入值，來推導(dǎo)滴度。臨床免疫原性的分析與報(bào)告 與預(yù)定的臨床研究策略（如：在關(guān)鍵臨床研究中設(shè)定的劑量）相關(guān)的綜合性的免疫原性分析策略和計(jì)劃對(duì)于闡明免疫原性數(shù)據(jù)的臨床相關(guān)性至關(guān)重要。 應(yīng)當(dāng)使用靈敏和驗(yàn)證過的分析方法對(duì)ADA進(jìn)行測試，并采用適當(dāng)?shù)牟呗詠黻U明免疫原性。在檢測到ADA之后，特別是在后期臨床研究中，需要評(píng)估ADA反應(yīng)的強(qiáng)度（滴度）與其體外的中和能力。ADA的其他特征，如免疫球蛋白亞型（subclass）或等型（isotype）的測定、域映射（domain-mapping）、相對(duì)結(jié)合親和力、與內(nèi)源性蛋白質(zhì)的交叉反應(yīng)性或ADA的補(bǔ)體激活能力，也可能需要評(píng)估，但這往往取決于對(duì)特定產(chǎn)品、特定臨床適應(yīng)癥或某些基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的需要。 還可以根據(jù)動(dòng)力學(xué)特性進(jìn)一步描述ADA的屬性，即藥物暴露后，什么時(shí)候這些抗體最早出現(xiàn)（ADA的發(fā)生，onset）以及持續(xù)多長時(shí)間（ADA的持續(xù)時(shí)間，duration）。ADA的任何上述屬性和動(dòng)力學(xué)特征都可能與其臨床效果相關(guān)。因此，臨床研究的ADA結(jié)果可以表述為：（a）ADA免疫反應(yīng)的特征；（b）ADA與藥代動(dòng)力學(xué)（PK）的關(guān)系，以及藥效動(dòng)力學(xué)（PD）生物標(biāo)志物的關(guān)系；（c）ADA與所測試藥物的臨床安全性和有效性的關(guān)系。 ADA的臨床后果可能從沒有明顯臨床效果到療效缺失（初級(jí)治療失敗）、療效損失（次級(jí)治療失?。┗蛞蛏锼幬锉┞读扛淖兌幮г鰪?qiáng)、藥物不良反應(yīng)（與給藥有關(guān)的全身或部位反應(yīng)），以及嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)（過敏和與內(nèi)源性分子的交叉反應(yīng)和中和相關(guān)的獨(dú)特的臨床問題）。因此，詳細(xì)考察ADA或其屬性與各種臨床后遺癥之間的任何關(guān)聯(lián)就變得非常重要。 一方面，清除性ADA的免疫反應(yīng)（對(duì)PK的影響明顯）和非清除但是中和性的ADA響應(yīng)（如低滴度的NAb對(duì)PD的明顯影響）可能會(huì)對(duì)臨床療效產(chǎn)生負(fù)面影響，但另一方面，ADA的存在并不一定排除ADA陽性患者使用該藥物，因?yàn)榕R床藥效最終取決于ADA對(duì)PK和PD的影響程度。因此，ADA與PK/PD的關(guān)系是一個(gè)重要的附加考慮因素，但并不一定就會(huì)導(dǎo)致臨床上的不良后果。 特別聲明 本文如有疏漏和誤讀相關(guān)指南和數(shù)據(jù)的地方，請(qǐng)讀者評(píng)論和指正。所有引用的原始信息和資料均來自已經(jīng)發(fā)表學(xué)術(shù)期刊、官方網(wǎng)絡(luò)報(bào)道等公開渠道，不涉及任何保密信息。參考文獻(xiàn)的選擇考慮到多樣化但也不可能完備。歡迎讀者提供有價(jià)值的文獻(xiàn)及其評(píng)估。 參 考 文 獻(xiàn)1. Guidance for industry: immunogenicityassessment for therapeutic protein products. In: U.S. Department of Health andHuman Services (DHHS), Food and Drug Administration (FDA), Center for DrugEvaluation and Research (CDER), Center for Biologics Evaluation and Research(CBER).http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM338856.pdf2013.Accessed 18 Mar 2014.2. Shankar G, et al. Assessment andreporting of the clinical immunogenicity of therapeutic proteins and peptides –harmonized terminology and tactical recommendations. AAPS J. 16(4), 658–673(2014). 3. Mire-Sluis AR, et al.immunoassays used in the detection ofhost antibodies against biotechnology products. J. Immunol. Methods 289, 1–16 (2004). 4. Shankar G, et al. Recommendations forthe validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnologyproducts. J. Pharm. Biomed. Anal. 48(5), 1267–81 (2008). 5. Smith HW, Moxness M, Marsden R. Summaryof confirmation cut point discussions. AAPS J. 13(2), 227–229 (2011). 6. Swanson JS, Chirmule N. Assessingspecificity for immunogenicity assays. Bioanalysis 1(3), 611–7 (2009). 7. Schellekens H. Bioequivalence and theimmunogenicity of biopharmaceuticals. Nat Rev Drug Discov. 2002;1(6):457–62. 8. Kuus-Reichel K, et al. Willimmunogenicity limit the use, efficacy, and future development of therapeuticmonoclonal antibodies? Clin Diagn Lab Immunol. 1994;1(4):365–72. 9. Koren E, Zuckerman LA, Mire-Sluis AR.Immune responses to therapeutic proteins in humans—clinical significance,assessment and prediction. Curr Pharm Biotechnol. 2002;3(4):349–60. 10. Schellekens H, Casadevall N.Immunogenicity of recombinant human proteins: causes and consequences. JNeurol. 2004;251 Suppl 2:II4–9. doi:10.1007/s00415-004-1202-9. 11. Wolbink GJ, Aarden LA, Dijkmans BA.Dealing with immunogenicity of biologicals: assessment and clinical relevance.Curr Opin Rheumatol. 2009;21(3):211–5. 12. Yanai H, Hanauer SB. Assessing responseand loss of response to biological therapies in IBD. Am J Gastroenterol. 2011;106(4):685–98. 13. Casadevall N, et al. Pure red-cellaplasia and antierythropoietin antibodies in patients treated with recombinanterythropoietin. N Engl J Med. 2002;346(7):469–75. 14. Macdougall IC. Antibody-mediated purered cell aplasia (PRCA): epidemiology, immunogenicity and risks. Nephrol DialTransplant. 2005;20 Suppl 4:iv9–iv15. 15. Schellekens H. Immunogenicity oftherapeutic proteins: clinical implications and future prospects. Clin Ther.2002;24(11):1720–40. 16. Shankar G, Pendley C, Stein KE. Arisk-based bioanalytical strategy for the assessment of antibody immuneresponses against biological drugs. Nat Biotechnol. 2007;25(5):555–561. 17. Koren E, Smith HW, Shores E, Shankar G,Finco-Kent D, Rup B, et al. Recommendations on risk-based strategies fordetection and characterization of antibodies against biotechnology products. JImmunol Methods. 2008;333(1–2):1–9. 18. 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Predictive value ofpersistent versus transient antiphospholipid antibody subtypes for the risk ofthrombotic events in pediatric patients with systemic lupus erythematosus.Blood. 2005;106(13):4152–4158. 24. Chirmule N, Jawa V, Meibohm B.Immunogenicity to therapeutic proteins: impact on PK/PD and efficacy. AAPSJ.2012;14(2):296–302. 關(guān)于博濟(jì)醫(yī)藥 臨床研究服務(wù)： 博濟(jì)醫(yī)藥擁有一支規(guī)模龐大、專業(yè)成熟的臨床研究隊(duì)伍，可提供包括醫(yī)學(xué)、項(xiàng)目管理、監(jiān)查、稽查、數(shù)據(jù)管理和統(tǒng)計(jì)分析、生物樣本檢測在內(nèi)的臨床試驗(yàn)全流程解決方案。截至2020年，博濟(jì)醫(yī)藥服務(wù)的客戶超1000家，完成800多項(xiàng)臨床試驗(yàn)項(xiàng)目，助力客戶獲得新藥證書60多項(xiàng)、生產(chǎn)批件超過80項(xiàng)。在有豐富的臨床試驗(yàn)服務(wù)經(jīng)驗(yàn)，服務(wù)項(xiàng)目涵蓋臨床研究各個(gè)領(lǐng)域，在腫瘤、肝病、消化等創(chuàng)新藥領(lǐng)域擁有獨(dú)特的臨床服務(wù)體系。 博濟(jì)醫(yī)藥在全國設(shè)有40多個(gè)臨床監(jiān)查網(wǎng)點(diǎn)，與全國近600個(gè)臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)展開合作，并運(yùn)用ORACLE OC/RDC及CTMS系統(tǒng)，控制臨床數(shù)據(jù)采集的及時(shí)性、管理臨床試驗(yàn)過程的規(guī)范性。
2021-09-07
今天下午（9月3日），CDE官網(wǎng)連發(fā)4份文件，涉及化學(xué)創(chuàng)新藥早期臨床研究、患者報(bào)告結(jié)局在藥物臨床研究中應(yīng)用、藥物臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)管理與統(tǒng)計(jì)、新冠肺炎新藥研發(fā)等多個(gè)領(lǐng)域。 化藥創(chuàng)新藥方面，CDE發(fā)布《化學(xué)藥創(chuàng)新藥臨床單次和多次給藥劑量遞增藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（征求意見稿）》，該文件共涵蓋前言、總體考慮、研究設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析、研究報(bào)告等5個(gè)方面，征求意見時(shí)間為1個(gè)月。文件合集 在患者報(bào)告結(jié)局在藥物臨床研究中應(yīng)用領(lǐng)域，CDE發(fā)布了《患者報(bào)告結(jié)局在藥物臨床研究中應(yīng)用的指導(dǎo)原則（征求意見稿）》，該文件共涉及引言，患者報(bào)告結(jié)局定義，患者報(bào)告結(jié)局測量量表的研發(fā)、翻譯、改進(jìn)，患者報(bào)告結(jié)局測量量表的選擇與評(píng)價(jià)，臨床研究中使用患者報(bào)告結(jié)局的考慮，電子化患者報(bào)告結(jié)局，與審批機(jī)構(gòu)溝通交流等7個(gè)方面，征求意見時(shí)間為1個(gè)月。文件合集 在藥物臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)管理與統(tǒng)計(jì)方面，CDE發(fā)布了《藥物臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)管理與統(tǒng)計(jì)分析計(jì)劃指導(dǎo)原則（征求意見稿）》，該文件共有前言、數(shù)據(jù)管理計(jì)劃、統(tǒng)計(jì)分析計(jì)劃、參考文獻(xiàn)4個(gè)部分組成，征求意見時(shí)間為1個(gè)月。文件合集 在新冠肺炎新藥研發(fā)方面，CDE出臺(tái)了《新型冠狀病毒肺炎抗病毒治療及預(yù)防新藥臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》（征求意見稿）。該文件共涵蓋了概述、早期臨床試驗(yàn)、探索性臨床試驗(yàn)、確證性臨床試驗(yàn)等4個(gè)部分，征求意見時(shí)間為1個(gè)月。 文件合集關(guān)于博濟(jì)醫(yī)藥 臨床研究服務(wù)： 博濟(jì)醫(yī)藥擁有一支規(guī)模龐大、專業(yè)成熟的臨床研究隊(duì)伍，可提供包括醫(yī)學(xué)、項(xiàng)目管理、監(jiān)查、稽查、數(shù)據(jù)管理和統(tǒng)計(jì)分析、生物樣本檢測在內(nèi)的臨床試驗(yàn)全流程解決方案。截至2020年，博濟(jì)醫(yī)藥服務(wù)的客戶超1000家，完成800多項(xiàng)臨床試驗(yàn)項(xiàng)目，助力客戶獲得新藥證書60多項(xiàng)、生產(chǎn)批件超過80項(xiàng)。擁有豐富的臨床試驗(yàn)服務(wù)經(jīng)驗(yàn)，服務(wù)項(xiàng)目涵蓋臨床研究各個(gè)領(lǐng)域，在腫瘤、肝病、消化等創(chuàng)新藥領(lǐng)域擁有獨(dú)特的臨床服務(wù)體系。 博濟(jì)醫(yī)藥在全國設(shè)有40多個(gè)臨床監(jiān)查網(wǎng)點(diǎn)，與全國近600個(gè)臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)展開合作，并運(yùn)用ORACLE OC/RDC及CTMS系統(tǒng)，控制臨床數(shù)據(jù)采集的及時(shí)性、管理臨床試驗(yàn)過程的規(guī)范性。
2021-09-03
?此前，“袁來如此”專欄根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)資料，對(duì)PK定量方法的設(shè)計(jì)作初步介紹（袁來如此 | 大分子生物分析概論（十四_上）：LBA定量分析雙特異性生物藥的挑戰(zhàn)）。本期將延續(xù)上期內(nèi)容，重點(diǎn)就相關(guān)案例分析、復(fù)雜藥物分子的未來生物分析技術(shù)以及前景等方面進(jìn)行探討。 “袁來如此”專欄系廣州博濟(jì)醫(yī)藥微信公眾號(hào)打造的科普學(xué)術(shù)專欄，內(nèi)容均為博濟(jì)醫(yī)藥藥物研究中心資深科學(xué)顧問袁智博士原創(chuàng)。 案例分析（Case studies） 以下案例研究是為了說明對(duì)于雙特異性分子而言，生物分析的獨(dú)特考慮，其適用于在藥物開發(fā)的不同階段設(shè)計(jì)和實(shí)施定量生物分析和PK評(píng)估。案例分析1：在非臨床研究中定量總和完整雙特異性藥物并評(píng)估ADA對(duì)PK的影響。 化合物X是一種基于支架的針對(duì)兩種細(xì)胞因子的雙特異性抗體。初步數(shù)據(jù)表明，這種特殊的支架產(chǎn)品平臺(tái)可以在非臨床物種中高頻率地誘導(dǎo)免疫原性。為了更好地解釋ADAs存在時(shí)的毒理學(xué)發(fā)現(xiàn)，生物分析小組決定開發(fā)兩種不同的PK方法來測定動(dòng)物血清中的總藥物和完整藥物的濃度?？侾K方法是使用兩種抗體對(duì)支架的框架進(jìn)行分析。完整的PK方法是使用一種靶向細(xì)胞因子作為捕獲試劑，另一種作為檢測試劑?？梢杂^察到，使用兩種PK方法分析相同的樣品產(chǎn)生的濃度與時(shí)間關(guān)系幾乎完全等同，除了在較晚的時(shí)間點(diǎn)之外，藥物濃度非常低的時(shí)候，即完整藥物濃度略低于總藥物濃度的時(shí)候。 在這些時(shí)間點(diǎn)觀察到的低濃度差異只發(fā)生在少數(shù)受試者上。因此，ADA和生物轉(zhuǎn)化（biotransformation）被認(rèn)為是最可能的根本原因。需進(jìn)行一項(xiàng)研究以確定這種差異的根本原因，如生物轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)的不穩(wěn)定性，靶標(biāo)干擾（target interference）和ADA干擾。為了驗(yàn)證這種雙特異性分子的體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化，例如，蛋白質(zhì)水解是否揭示了影響穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)缺陷，故開發(fā)了兩種配體結(jié)合質(zhì)譜(ligand-binding mass spectrometry，LBMS)方法，使用抗人Fc免疫親和捕獲和靶目標(biāo)捕獲，然后進(jìn)行分層次的質(zhì)譜分析。采用與ESI-MS相結(jié)合的納米級(jí)液相色譜法對(duì)非多種代謝產(chǎn)物進(jìn)行了更高分辨率的分離和鑒定。 數(shù)據(jù)顯示，生物轉(zhuǎn)化的結(jié)果為陰性。ADA分析表明雙特異性分子比其母體藥物的ADA出現(xiàn)頻率更高。盡管隨后通過免疫原性表征，證實(shí)大多數(shù)ADAs并非中和性ADAs，但發(fā)現(xiàn)ADAs有助于快速地清除完整藥物。這些數(shù)據(jù)也可以解釋為當(dāng)藥物濃度足夠低時(shí)，內(nèi)源性細(xì)胞因子占據(jù)了特定的捕獲/檢測位點(diǎn)，即存在靶標(biāo)干擾。結(jié)果表明，該藥物在體內(nèi)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。PK數(shù)據(jù)差異與完整藥物的不穩(wěn)定性無關(guān)，而更可能是由于ADAs高水平導(dǎo)致清除藥物的速度更快。案例分析2：一個(gè)F(ab’)2在體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化為兩個(gè)活性F(ab)單體的PK分析。 本案例研究涉及一個(gè)雙特異性F(ab’)2，由一個(gè)anti-VEGF arm和一個(gè)anti-Ang2 arm組成，用于玻璃體內(nèi)注射（intravitreal administration）治療視網(wǎng)膜變性疾病，如濕性老年性黃斑變性和糖尿病性黃斑水腫。據(jù)報(bào)道，針對(duì)F(ab’)2抗體鉸鏈區(qū)的，先前存在的內(nèi)源性抗體(PEA)存在于很大比例的人群中。在未接受藥物的食蟹猴和人血清樣本中，都證實(shí)了這一點(diǎn)。移除這些預(yù)先存在的內(nèi)源性抗體的鉸鏈表位（hinge epitopes）使得該分子中只有單個(gè)二硫鍵將兩個(gè)fab結(jié)合在一起。 因此，注射入玻璃體（其含有g(shù)lutathione作為抗氧化產(chǎn)品的一部分，以保證晶狀體的完整性）后，藥物分子生物轉(zhuǎn)化為individual Fabs，相關(guān)清除率(t1/2 <1天)，通常比兔玻璃體的Fab (t1/2 約3天)或F(ab’)2 (t1/2 約3天)的清除率要大(未發(fā)表的觀察結(jié)果)。 備注：一般情況下，t1/2與清除率的關(guān)系如下，即半衰期還取決于藥物分布體積；如果假設(shè)分布體積恒定，則t1/2與清除率之間的關(guān)系是確定成反比的： 因此，完整的F(ab’)2和individual Fab碎片均存在于眼腔(玻璃體和水相之中)和系統(tǒng)循環(huán)之中。正如所預(yù)料的，嚙齒類動(dòng)物脈絡(luò)膜新生血管模型（rodent choroidal neovascularization models）顯示，individual Fabs保留了生物活性。為了全面地描述活性藥物暴露量的特征，有必要定量這3種藥物形式。因此，開發(fā)并驗(yàn)證了3種單獨(dú)的PK定量方法。此前有學(xué)者曾經(jīng)考慮過使用一種總PK定量方法來測定所有這3種形式。但是，該分子是一個(gè)新穎結(jié)構(gòu)，故有必要闡明其生物轉(zhuǎn)化的動(dòng)力學(xué)，這對(duì)于描述該分子體內(nèi)的行為是很重要的。 定量完整待測物的ELISA方法使用固定的（immobilized）重組蛋白Ang2捕獲待測物，然后加入biotin-VEGF，最后加入streptavidin-HRP，是一個(gè)sequential sandwich格式。外加待測物的回收率實(shí)驗(yàn)證明這種測試格式僅能夠特異性地檢測F(ab’)2，但檢測不到兩種Fab分子中的任何一個(gè)。定量兩個(gè)Fab分子的方法都采納類似的基本格式：使用各自的靶標(biāo)-Ang2或靶標(biāo)-VEGF，從樣本中捕獲Fabs。然后加入biotin-sheep antihuman IgG的重鏈和輕鏈(H&L)，最后，加入streptavidin-HRP進(jìn)行檢測。 值得注意的是，采用測定Fab的格式，也可以檢測到完整分子。盡管使用Fabs作為標(biāo)準(zhǔn)品（standards）和對(duì)照品（controls），在分析Fab時(shí)，也定量了完整F(ab’)2。此外，使用F(ab’)2和任何一個(gè)Fab的混合物，可以通過從完整分子（高特異性）的定量結(jié)果中減去Fab結(jié)果來定量另一個(gè)Fab。已經(jīng)驗(yàn)證了所有這些分析方法，并用于兔血清樣本的非臨床研究，也認(rèn)證了這些方法可用于食蟹猴的血清和水/玻璃體/視網(wǎng)膜的萃取物中藥物的定量。血清定量分析的另一個(gè)挑戰(zhàn)是幾個(gè)ng/ml甚至更低的藥物濃度，這也是玻璃體腔生物藥給藥的一致特點(diǎn)：給藥量很小(通常是<1 mg/eye)；藥物在到達(dá)系統(tǒng)循環(huán)時(shí)，經(jīng)歷了高倍數(shù)的稀釋。案例分析3：在非臨床研究中監(jiān)測體內(nèi)雙特異性藥物生物轉(zhuǎn)化的總和活性（total and active）藥物的定量。 一個(gè)針對(duì)腫瘤適應(yīng)癥的雙特異性單克隆抗體靶向兩個(gè)細(xì)胞表面的抗原，其藥理作用取決于單克隆抗體的兩個(gè)結(jié)合臂（both binding arms）的完整。然而，在體外生物物理表征過程中，在其中一個(gè)結(jié)合臂中發(fā)現(xiàn)了翻譯后修飾(post-translational modification，PTM)的問題。但這種PTM，不能在不顯著損害生物活性的情況下，通過蛋白質(zhì)工程而排除，因?yàn)樵诓环€(wěn)定的氨基酸上的點(diǎn)突變（point mutation）會(huì)完全破壞單抗與靶標(biāo)的結(jié)合。此外，僅具有第二個(gè)結(jié)合臂功能的藥物變異體的累積，可能會(huì)屏蔽活性藥物結(jié)合第二個(gè)靶點(diǎn)，并可能在多次給藥后誘發(fā)毒性反應(yīng)。 對(duì)該單抗體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化的特征進(jìn)行研究是勢在必行的，如轉(zhuǎn)化的動(dòng)力學(xué)和程度，這可以為進(jìn)一步開發(fā)該單抗提供指導(dǎo)。隨后，使用與分子的Fc部分特異性結(jié)合的測試試劑開發(fā)了一個(gè)橋接格式的總藥物PK定量方法，輔之以一種活性藥物PK定量方法：即使用靶標(biāo)蛋白作為PTM-liable functional domain的捕獲試劑，使用抗人Fc試劑作為檢測試劑。利用野生型和擁有點(diǎn)突變的藥物的混合比例，活性PK方法，在總藥物存在的情況下，能夠區(qū)分和準(zhǔn)確測定活性藥物的百分比。之后，評(píng)估了該藥物分子在食蟹猴上的PK特性。使用了總和活性PK定量方法來測定研究樣本中總和活性藥物的濃度。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)，體內(nèi)樣品中的藥物出現(xiàn)了PTM，并且活性藥物濃度百分比隨時(shí)間而降低?；诮：头抡?，可以在臨床研究中減少劑量間隔來減輕活性藥物濃度的降低。非臨床研究結(jié)果有助于決定使用活性PK定量方法作為支持臨床研究的主要方法。而在FIH研究中，總PK定量方法可用于進(jìn)一步描述無活性藥物變異體（inactive drug variants）潛在的累積及其對(duì)PK/PD和毒性的影響。復(fù)雜藥物分子的未來生物分析技術(shù) 如表1中所總結(jié)的，一般需要多種PK定量方法和ADA方法評(píng)估ADC和雙特異性抗體的基礎(chǔ)藥代動(dòng)力學(xué)和免疫原性。分析方法數(shù)量的增加給樣本的收集、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、分析和分析方法的生命周期管理帶來了巨大的負(fù)擔(dān)。在某些情況下，由于樣本數(shù)量有限，根本不可能進(jìn)行多次分析。對(duì)于增加的功能域和潛在的生物轉(zhuǎn)化，僅僅增加分析方法的數(shù)量以滿足生物分析需求似乎是一個(gè)直接的解決方案，但“兩點(diǎn)式two-point”結(jié)合方法（如夾心式LBA）并不適合評(píng)估具有多域（>3）構(gòu)造的分子“完整性intactness”。盡管免疫捕獲（IC-）-LC-MS/MS方法在理論上可以識(shí)別來自多個(gè)功能域的特征肽，但有關(guān)“完整性”和功能的信息仍然缺失。因此，隨著復(fù)雜藥物模式（complex drug modalities）的生物轉(zhuǎn)化越來越受到的關(guān)注，定量LBA方法和（IC-）LC-MS/MS方法往往無法對(duì)潛在的生物轉(zhuǎn)化提供相關(guān)信息。正如CovX-Body和基于框架（scaffold-based）的雙特異性抗體的案例所表明的那樣，PK行為的意外不一致觸發(fā)了潛在生物轉(zhuǎn)化的嫌疑，進(jìn)而就需要新的分析方法來進(jìn)一步研究。表1.ADC和雙特異性抗體的PK定量方法（SCR，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍；ECL，電化學(xué)發(fā)光；N.A.，不適用）備注：表格中參考文獻(xiàn)的標(biāo)注不適用。 因此，使用multiplexed PK/ADA方法以測定完整藥物、各種變構(gòu)體（variants）和相關(guān)的ADA是非常需要的，同時(shí)，也對(duì)潛在的生物轉(zhuǎn)化提供相關(guān)信息。Multiplexed檢測方法已在聯(lián)合療法中有早期應(yīng)用，但尚未看到對(duì)復(fù)雜藥物模式“biotransformation ready”的multiplexed測試方法，用以幫助評(píng)估復(fù)雜藥物的完整性，表征各種生物轉(zhuǎn)化，并測試對(duì)藥物/藥物變構(gòu)體各部分的免疫反應(yīng)。下文將簡單介紹對(duì)復(fù)雜藥物模式有希望的兩項(xiàng)生物分析技術(shù)：HR-MS定量分析完整蛋白質(zhì)和毛細(xì)管Western Blot定量分析。HR-MS 定量分析完整蛋白質(zhì) 與針對(duì)完整藥物分子中某個(gè)選定區(qū)域的LBA和LC-MS/MS技術(shù)相比，完整蛋白質(zhì)的定量分析旨在將一個(gè)復(fù)雜的藥物分子作為一個(gè)整體來研究，這能夠揭示重要的高層次結(jié)構(gòu)和生物轉(zhuǎn)化的相關(guān)信息。完整蛋白的LC-MS分析通常用作對(duì)生物轉(zhuǎn)化研究的定性分析。Murphy等人使用IC-LC Q-ToF MS，在CovX-Body雙特異性抗體上發(fā)現(xiàn)并鑒別了蛋白酶剪切掉的含有8個(gè)氨基酸的肽段。He等人利用高分辨率的QTOF-MS與IC-LC相結(jié)合，成功地在小鼠血漿中，鑒別了若干不同DARs的ADC和生物轉(zhuǎn)化了的變異體（biotransformed variants，由于增加/刪除了hexose, glutathione, cysteine以及l(fā)inker-drug）。近年來，HR-MS在靈敏度和質(zhì)量分辨率方面的提高，逐漸使其在定量生物分析中得以有更廣泛的應(yīng)用。 Jian等人建立了IC-LC-QTOF-MS的工作流程，用于小鼠血漿中人類mAbs的絕對(duì)定量。定量的下限（LLOQ）為1000ng/mL（20 ?L血漿樣品），并可降至250ng/mL，如果使用200?L樣品。在優(yōu)化其數(shù)據(jù)處理策略后，LLOQ降至50ng/mL。使用所述工作流程，Jian等人隨后展示了GLP1-Fc融合蛋白的定量；同時(shí)，在對(duì)小鼠的研究過程中，識(shí)別了該藥物的兩種主要蛋白酶降解產(chǎn)物。 Lanshoeft等人驗(yàn)證了基于multiplex IC-LC-HRMS的PK定量方法，并用于非臨床PK研究，該方法同時(shí)定量分析了大鼠血清中兩個(gè)人類IgG1。類似地，Jin等人在大鼠血清中定量了完整的trastuzumab emtansine（一種ADC）及其主要的DAR物種，其定量下限值約為20ng/mL，線性動(dòng)態(tài)范圍為5-100?g/mL。 另一個(gè)有趣的應(yīng)用是最近Zhang等人報(bào)道的，在非變性LC條件下對(duì)native intact mAb進(jìn)行的定量分析，這可能為使用LC-HR-MS技術(shù)以multiplex的方式建立結(jié)合（bound）/未結(jié)合（unbound）PK定量方法以及其它各種功能域PK的定量方法提供了機(jī)會(huì)。毛細(xì)管Western Blot定量分析方法 毛細(xì)管Western blot，也稱為毛細(xì)管納米免疫測定（capillary nanoimmunoassay，CNIA），已由制造商Protein Simple(San Jose, CA)商業(yè)化的Simple Western system，是指毛細(xì)管電泳免疫測定系統(tǒng)，它提供基于蛋白質(zhì)大小和電荷的分離格式。與在分離和檢測之前進(jìn)行配體結(jié)合的IC-LC-MS技術(shù)不同，Western blot首先分離蛋白質(zhì)，然后使用配體結(jié)合作為檢測方法。因此，它能夠使用multiplexed immunoassay，同時(shí)檢測完整的蛋白質(zhì)及其生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物，并對(duì)變異的各種功能域進(jìn)行表征。 目前，毛細(xì)管Western Blot定量分析在蛋白質(zhì)藥物的PK研究中應(yīng)用仍然有限。Li等人在小鼠研究中驗(yàn)證了無濃縮的PK方法，以定量小鼠血漿中的polyhistidine N-和FLAG C-terminally-tagged重組蛋白（約55kDa），其LLOQ為20ng/mL。Anti-FLAG tag抗體在immunoblot步驟中用作初級(jí)抗體。研究發(fā)現(xiàn)，只需以1:100至1:500的比例稀釋樣品，即可消除基質(zhì)中高豐度蛋白的干擾。 此外，Kodani等人使用capillary western blot檢測到丙型肝炎病毒（HCV）的IgG抗體，表明其在抗藥物抗體（ADA）檢測方面的潛在應(yīng)用。重組HCV蛋白首先在毛細(xì)管中分離和固定。稀釋的人類血清隨后在毛細(xì)管中孵育，使抗HCV抗體與固定的抗原結(jié)合。這一步驟之后，使用抗人類IgG-HRP抗體再進(jìn)行第二次孵育。在70個(gè)特表征良好的人血清樣本的檢測中，該方法與另一種市售的抗HCV抗體測試方法的相關(guān)性良好。結(jié)論 為了解決雙特異性分子開發(fā)過程中所需的生物分析支持，本文討論了在開發(fā)這些藥物分子的PK分析策略時(shí)一些獨(dú)特的考慮。本文提出的策略和方法可以應(yīng)用于雙特異性分子和其它多域大分子藥物，這需要對(duì)特定的藥物分子其作用機(jī)制（MOA）和潛在的靶標(biāo)生物學(xué)，以及評(píng)估PK/PD的所需要的數(shù)據(jù)有全面的了解。 大分子生物分析行業(yè)需要新的定量分析技術(shù)來開發(fā)multiplexed PK定量方法，以便定量復(fù)雜模式的藥物及其生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。用于完整蛋白質(zhì)分析的（IC-）LC-HR-MS和capillary Western blot技術(shù)擁有很大應(yīng)用前景，因其multiplexibility和提供目標(biāo)待測物的多維信息（如分子量等電點(diǎn)和域功能/domain functionality）的能力。在過去幾年中， HR-MS和capillary Western blot platforms的定量靈敏度有了顯著改善，盡管這些技術(shù)仍需要進(jìn)一步改善，以獲得更廣泛的接受。當(dāng)前HR-MS系統(tǒng)的一般操作相對(duì)簡單，但HR-MS（以及capillary Western blot）的數(shù)據(jù)分析、解釋和驗(yàn)證，從監(jiān)管的角度看，還需要進(jìn)一步明確。 從理想的和雄心勃勃的角度思考，最好將PK/PD/免疫原性/生物轉(zhuǎn)化的生物分析整合到一個(gè)分析測試方法之中，以減少藥物開發(fā)所需的資源，并促進(jìn)在同一組患者樣本中全面闡明藥物的PK/PD行為。設(shè)計(jì)和開發(fā)這樣的定量分析的方法，對(duì)每一種生物藥結(jié)構(gòu)都是獨(dú)特的，需要一種徹底的“適合其用途”的方法及其確認(rèn)（confirmation）。為雙（多）特異性分子開發(fā)可靠、穩(wěn)健和可重現(xiàn)的PK分析方法是非常具有挑戰(zhàn)性的，因?yàn)槎喾N因素會(huì)影響準(zhǔn)確（accurate）而有意義（meaningful）的濃度測定值。未來生物分析行業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)指導(dǎo)定量分析這些高度復(fù)雜的生物（蛋白）藥的最佳做法的討論和意見，將會(huì)極具價(jià)值。未來前景 隨著生物分析方法的特異性、選擇性和靈敏度的不斷提高，更準(zhǔn)確（accurate）和更精密（precise）的測定雙特異性抗體濃度和評(píng)估其在生物樣品中的免疫原性將成為可能。預(yù)計(jì)雙特異性和多特異性生物藥的數(shù)量和種類將繼續(xù)擴(kuò)大，這將促進(jìn)新的生物分析方法的開發(fā)，以適應(yīng)這些分子的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和MOAs。 當(dāng)然，目前的方法將被用于新的蛋白藥物的定量。盡管LBA方法是目前生物分析方法的首要選擇，并且在可以預(yù)見的未來仍將如此，LC-MS/MS方法，由于其與生俱來的multiplexed的定量分析能力，可能會(huì)得到更加廣泛地應(yīng)用，以支持雙特異性生物藥的PK評(píng)估。LC-MS/MS比LBA分析具有更少的分析變異性（variability）和關(guān)鍵試劑的可及性（availability）問題。預(yù)期分析實(shí)驗(yàn)室的自動(dòng)化將擴(kuò)展到生物分析的所有階段，以減少人工錯(cuò)誤和提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。特別聲明 本文如有疏漏和誤讀相關(guān)指南和數(shù)據(jù)的地方，請(qǐng)讀者評(píng)論和指正。所有引用的原始信息和資料均來自已經(jīng)發(fā)表學(xué)術(shù)期刊、官方網(wǎng)絡(luò)報(bào)道等公開渠道, 不涉及任何保密信息。參考文獻(xiàn)的選擇考慮到多樣化但也不可能完備。歡迎讀者提供有價(jià)值的文獻(xiàn)及其評(píng)估。 參 考 文 獻(xiàn)1.Zhu, L, et al. 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2021-08-30
